田鳳鳴 陳 強(qiáng) 何九軍 卓平清 王讓軍

（1隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院 甘肅 隴南 742500；2隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心 甘肅 隴南 742500）

1978年，細(xì)菌生物膜(BBF)由Costerton等人第1次提出，是一種微生物聚集群落，附著在生物或非生物的表面[1]。生物膜具有著非常重要的作用，例如能夠很好的抵御外界有害物質(zhì)的入侵、調(diào)整細(xì)菌間的協(xié)調(diào)代謝、降低遺傳物質(zhì)的橫向傳遞及外部環(huán)境壓力等[2]，是細(xì)菌群體合作和競爭并存的一種方式。BBF的形成會受到不同環(huán)境因素如溫度、pH值、鹽濃度、金屬離子等方面的影響。在適宜條件下，細(xì)菌均能形成BBF，但形成BBF的能力因環(huán)境的影響會出現(xiàn)差異，有的因素能促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，有的因素能抑制細(xì)菌生物膜的形成[3]。

目前關(guān)于芽孢桿菌生物膜形成條件的報道很多，例如馮靜靜[2]等獲得了納豆芽孢桿菌生物膜形成的最佳條件，李南薇[4]等獲得了蠟樣芽孢桿菌生物被膜生長的最佳條件，吳園園[5]等獲得了枯草芽孢桿菌NCD-2菌株生物膜形成的最佳條件。徐志輝[6]研究中發(fā)現(xiàn)不同濃度的鐵離子對解淀粉芽孢桿菌SQR9生物膜的形成具有不同作用，具有低鐵促進(jìn)高鐵抑制的現(xiàn)象。但關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌生物膜生長條件的探索報道甚少，特別是貝萊斯芽孢桿菌作為一種對花椒根腐病具有拮抗作用的生防菌。

因此，本試驗(yàn)以花椒根腐病為指示菌，從健康花椒根系土壤中分離獲得的拮抗菌T-1為研究對象，探索不同因素(pH值、溫度、金屬離子、鹽濃度)對貝萊斯芽孢桿菌T-1細(xì)菌的生長和生物膜的形成條件，可為更多地了解該菌株的特性，進(jìn)一步研究貝萊斯芽孢桿菌T-1的拮抗機(jī)制及生物膜的形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。本試驗(yàn)中的供試花椒根腐病病原菌茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得、保存，拮抗菌貝萊斯芽孢桿菌T-1由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得、保存。2種病原菌前期的分離鑒定工作已經(jīng)完成，菌種保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂15～18g(液體培養(yǎng)基不加)，定容至1L，高壓滅菌20min。

1.1.3 主要試劑。無菌生理鹽水、甲醇、結(jié)晶紫染液、冰醋酸、硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、氯化鉀、硫酸銨，均由西安飛越化玻試劑公司提供。

1.2 拮抗菌T-1生長曲線的測定。將適量對數(shù)生長期的貝萊斯芽孢桿菌T-1菌液加入50mlLB液體培養(yǎng)基中，放置搖床中30℃，200rpm/min振蕩培養(yǎng)，每隔1h檢測1次菌液濃度，以O(shè)D590為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3 不同因素對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長及生物成膜的影響

1.3.1 pH值對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。①pH值對拮抗菌T-1生長的影響：用HCl和NaOH調(diào)節(jié)LB培養(yǎng)基的pH值為1～10，以未調(diào)pH值的培養(yǎng)基為對照組，將對數(shù)生長期的菌液T-1按照一定的比例接種于LB培養(yǎng)基中，每種條件設(shè)置3次重復(fù)，放置搖床中30℃，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h。②pH值對貝萊斯芽孢桿菌T-1生物成膜生長量的影響：取24孔無菌細(xì)胞板，每孔加入2ml上述培養(yǎng)好的菌液，空白對照以未加菌液的LB培養(yǎng)基為準(zhǔn)，在28℃培養(yǎng)箱中靜置24h后，小心吸去拮抗菌T-1菌液，將生物膜保留在細(xì)胞板內(nèi)，2ml無菌生理鹽水漂洗3～5次，后用2ml濃度為99%的甲醇沖洗，10～15min后棄去甲醇，將培養(yǎng)板倒扣在吸水紙上干燥，每孔中加入1ml結(jié)晶紫溶液染色5min后吸去染液，培養(yǎng)板繼續(xù)倒扣在吸水紙上進(jìn)行干燥，每孔中加入體積分?jǐn)?shù)為33%的冰乙酸2ml溶解于生物膜的結(jié)晶紫染液；以稀釋50倍的33%冰乙酸溶液作為空白對照，在OD570條件下測定生物膜的吸光度，每個處理重復(fù)3次。

1.3.2 鹽濃度對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。①鹽濃度對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長的影響：將LB培養(yǎng)基配制成含NaCl濃度為1%～9%的梯度，將對數(shù)生長期的菌液T-1按照一定的比例接種于LB培養(yǎng)基中，每種條件設(shè)置3次重復(fù)，放置搖床中30℃，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h。②鹽濃度對貝萊斯芽孢桿菌T-1生物成膜生長量的影響：此試驗(yàn)方法按照1.3.1測定方法進(jìn)行。

1.3.3 金屬離子對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。①金屬離子對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長的影響：將LB培養(yǎng)基分別配制成含有濃度為5g/L金屬 離 子 的FeSO4、(NH4)2SO4、MgSO4、ZnSO4、KCl、CuSO4培養(yǎng)基，將對數(shù)生長期的菌液T-1按照一定的比例接種于LB培養(yǎng)基中，每種條件設(shè)置3次重復(fù)，放置搖床中30℃，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h。②金屬離子對貝萊斯芽孢桿菌T-1生物成膜生長量的影響：此試驗(yàn)方法按照1.3.1測定方法進(jìn)行。

1.3.4 溫度對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。①溫度對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長影響：將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，放置搖床中，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h。②溫度對貝萊斯芽孢桿菌T-1生物成膜生長量的影響：此試驗(yàn)方法按照1.3.1測定方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理。結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(x,s)，用excel、SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌T-1生長曲線。圖1為貝萊斯芽孢桿菌T-1生長曲線，結(jié)果顯示：菌株T-1從第2h到第7h快速進(jìn)入對數(shù)生長期，之后保持一段穩(wěn)定期，從第9h以后進(jìn)入衰退期，通過生長曲線的測定，可以很好的掌握該菌在特定培養(yǎng)條件下的生長規(guī)律。

圖1 拮抗菌T-1生長曲線

2.2 不同因素對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長及生物成膜的影響

2.2.1 pH值對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。由圖2可知，pH值＜4和 pH值＞8時都不利于該菌的生長，生長緩慢，甚至沒有生長，pH值為5時該菌的生長速度最快；同時通過生物成膜生長量的測定結(jié)果顯示：pH值為7～9時，該菌生物成膜生長量最大，當(dāng)pH值＜6和pH值＞9時生物膜的生長量較低，這說明pH值對拮抗菌T-1的生長及生物成膜的影響差異明顯。

圖2 pH值對拮抗菌T-1的生長及生物成膜的影響

2.2.2 NaCl濃度對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。由圖3可知：拮抗菌T-1在NaCl濃度為1%～4%時生長良好，鹽濃度NaCl＞5%時生長速度降低，在8%時依然具有一定的生長量，說明該菌具有一定的耐鹽性；生物成膜生長量測定結(jié)果顯示：NaCl濃度為1%～4%時該菌生物成膜生長量逐漸升高，NaCl濃度為4%時生長量最高，Na-Cl濃度為5%～8%時成膜生長量逐漸降低，NaCl濃度為8%時生物成膜量依然能被檢測到。

圖3 NaCl濃度對拮抗菌T-1的生長及生物成膜的影響

2.2.3 金屬離子對貝萊斯芽孢桿菌T-1的生長及生物成膜的影響。由圖4可知，培養(yǎng)基中添加不同金屬離子對拮抗菌T-1的生長及生物成膜的影響存在明顯的差異，添加了Fe2+和Cu2+的培養(yǎng)基拮抗菌株生長顯著，其中Fe2+最有利于菌株的生長，生物成膜生長量測定結(jié)果顯示：Zn2+、NH4+、Mg2+、Cu2+、K+都能促進(jìn)拮抗菌T-1生物成膜的生長，其中Zn2+促進(jìn)作用最顯著，生物成膜量最高。

圖4 金屬離子對拮抗菌T-1的生長及生物成膜的影響

2.2.4 溫度對貝萊斯芽孢桿菌T-1生長及生物成膜的影響。由圖5可知：拮抗菌T-1在不同的溫度下其生長速度也不同，30℃～35℃時適于該菌的生長，35℃以上該菌的生長速度逐漸降低；生物成膜生長量的測定結(jié)果顯示：該菌在20℃～45℃時均具有生長量，30℃既是該菌最適合的生長溫度，也是該菌生物成膜量最高的溫度。

圖5 溫度對拮抗菌T-1的生長及生物成膜的影響

3 結(jié)論與討論

為了確定貝萊斯芽孢桿菌T-1生長和生物成膜條件，本試驗(yàn)測定了不同因素對拮抗菌T-1生長及生物成膜的影響，pH值、NaCl濃度、金屬離子、溫度對該菌的生長和生物成膜都有不同程度的影響。拮抗菌T-1生長的最適pH值為5，最適合的生長溫度為30℃，在NaCl濃度為1%～4%時該菌長勢依然良好，高鹽濃度不利于該菌的生長，低鹽濃度適于該菌的生長，在Fe2+的培養(yǎng)基中拮抗菌T-1生長最顯著。拮抗菌T-1生物成膜的最佳條件：最適pH值為7，最適合的生長溫度為30℃，在NaCl濃度為4%時生物成膜量最高，Zn2+對拮抗菌T-1生物成膜量的促進(jìn)最顯著。本文通過試驗(yàn)測定不同理化條件下菌株T-1生長和生物膜形成規(guī)律，為后期研究該菌的致病機(jī)理和防治措施奠定了理論基礎(chǔ)。