竺利紅，李孝輝，施躍峰

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，杭州 310021）

鐵皮石斛Dendrobium candidiumWall. ex Lindl.，為蘭科石斛屬的多年生附生型草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，其多糖成分，具有提高人體免疫力、抗氧化和抗腫瘤的功效，人工栽培已相當(dāng)普遍[1,2]。

鐵皮石斛喜歡溫暖陰濕的環(huán)境，病蟲發(fā)生危害逐年加重，尤其是葉片炭疽病更為嚴(yán)重，已成為制約鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化發(fā)展的主要因素之一[3,4]。該病由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起，主要危害葉片和莖桿，引起落葉甚至植株枯死，對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大[5]。而我國(guó)在鐵皮石斛上尚沒有一種登記藥劑，生產(chǎn)上濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象普遍，農(nóng)藥殘留超標(biāo)隱患大，“藥中藥”問題突出，嚴(yán)重威脅鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[6]。對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防治，急需安全高效的專用藥劑。

生物防治是目前植物病害防治的發(fā)展方向之一，其中微生物殺菌劑具有環(huán)境友好、安全性高等優(yōu)點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)[7]。已獲農(nóng)藥登記的微生物殺菌劑主要有芽胞桿菌類、木霉菌、假單胞菌類等[8]，登記作物包括水稻、小麥、番茄、煙草等，鐵皮石斛尚未在列。國(guó)內(nèi)外關(guān)于鐵皮石斛炭疽病的生物防治研究報(bào)道較少，少量研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室拮抗菌的分離篩選。曾欣等[9]通過離體葉片測(cè)定法發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensisB-11對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防效為64%。劉艷明等[10]通過平板對(duì)峙法測(cè)定了Ceriporiasp.F102等內(nèi)生真菌到對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑菌活性。為了保障鐵皮石斛的綠色高效種植，迫切需要更多有應(yīng)用前景的生防資源，因此很有必要分離篩選該病原菌的優(yōu)質(zhì)、高效拮抗菌。本研究從土壤中分離到一株芽胞桿菌Bacillussp. SM905，發(fā)現(xiàn)其對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌有較好的抑制作用，對(duì)其展開了菌種鑒定、抑菌活性測(cè)定和盆栽防治試驗(yàn)，為進(jìn)一步的田間應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株芽胞桿菌SM905、膠孢炭疽菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑由瑞士正先達(dá)作物保護(hù)有限公司生產(chǎn)。細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、PCR試劑、16S rDNA通用引物27F/1492R、gyrB測(cè)序引物UP-1S/UP-2Sr由生工工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)或合成。種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉5 g，葡萄糖1 g，水1000 mL，pH 7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮20 g，黃豆餅粉15 g，番薯淀粉10 g，NaCl 5 g，K2HPO43 g，MgSO41.5 g，水1000 mL，pH 7.5。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1000 mL，pH 自然。PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2 菌株SM905鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定 參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行。

1.2.2 分子鑒定 采用基因組DNA抽提試劑盒提取菌株SM905的總DNA，分別用16S rDNA和gyrB引物擴(kuò)增。16S rDNA擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。gyrB擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定后送生工工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果分別在Genbank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 菌株SM905發(fā)酵上清液和粉劑的制備

取新鮮培養(yǎng)的SM905斜面接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，即得種子液。取種子液（按5%的接種量計(jì)）接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至2/3芽胞脫落，取部分發(fā)酵液8000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm微孔過濾器，即得發(fā)酵上清液，4 ℃保存。剩余發(fā)酵液用助劑吸附、烘干，制備含孢量為100億CFU/g的粉劑，常溫避光保存。

1.4 菌株SM905對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌的抑制作用

1.4.1 對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性 采用平板對(duì)峙法[12]測(cè)定 SM905對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性。取新鮮培養(yǎng)的SM905斜面，用接種環(huán)蘸取少量接入到PDA培養(yǎng)基距中心25 mm的4個(gè)點(diǎn)，打孔器打取培養(yǎng)7 d的膠孢炭疽菌菌絲塊（d=6 mm）接入培養(yǎng)皿中央，培養(yǎng)5 d后觀察抑菌效果。

1.4.2 對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響 將膠孢炭疽菌菌絲塊接種在 PDB培養(yǎng)液，于 28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10 d 后，無菌擦鏡紙過濾，濾液即為孢子懸浮液。將發(fā)酵上清液與融化的PDA培養(yǎng)基混合，使其分別稀釋 5、10、20倍，對(duì)照組為空白PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻到45 ℃時(shí)，加入1 mL孢子懸浮液，迅速搖勻倒平板。每處理設(shè) 5 個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。每皿用打孔器隨機(jī)打3個(gè)孔，將取得的培養(yǎng)物置于光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)狀況，以孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子短半徑者為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

1.4.3 對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[13]測(cè)定不同濃度發(fā)酵上清液對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，將發(fā)酵上清液與融化的PDA培養(yǎng)基混合，使其分別稀釋5、10、20倍，以加入等體積無菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。倒平板，待冷卻后在平板中心接入膠孢炭疽菌菌絲塊（d=6 mm），每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，并利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，抑制率（%）=（對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-6）×100。

采用插片法[14]觀察菌絲的形態(tài)，即取5 mL SM905發(fā)酵上清液加入95 mL融化的PDA培養(yǎng)基中，混勻，對(duì)照組培養(yǎng)基中加入等量無菌水，倒平板。將無菌蓋玻片 30度角斜插入凝固的平板，在蓋玻片與培養(yǎng)基交接處接入膠孢炭疽菌菌絲。于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。取出蓋玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，另取少量菌絲于掃描電鏡進(jìn)一步形態(tài)觀察。

1.5 菌株SM905防治鐵皮石斛炭疽病盆栽試驗(yàn)

試驗(yàn)采用“雁蕩1號(hào)”品種，采用人工接種病原菌，即每盆噴施含孢量為107孢子/mL的鐵皮石斛膠孢炭疽菌孢子懸浮液10 mL，2 d后用于試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：（1）噴施SM905粉劑100倍液20 mL 1次；（2）間隔7 d噴施SM905粉劑100倍液20 mL 2次；（3）噴施10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑800倍液20 mL 1次；（4）噴施無菌水20 mL 1次。每處理30盆，重復(fù)3次。每個(gè)處理分別于首次施藥后15、30 d隨機(jī)調(diào)查30株鐵皮石斛，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)并計(jì)算防效。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～15%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積16%～25%；7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積26%～50%；9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。計(jì)算病情指數(shù)和防治效果，病情指數(shù)＝Σ（病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù)）/（最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100，利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株 SM905鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 SM905在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上呈淡黃色菌落，表面干燥且粗糙，邊緣不整齊。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，短桿狀，兩端鈍圓，單個(gè)、成對(duì)或成串出現(xiàn)，橢圓形芽胞，中生到次端生（圖1）。好氧，能利用葡萄、和乳糖、蔗糖、甘露醇和麥芽糖等，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，可水解淀粉和明膠，氧化酶反應(yīng)、V-P反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)和接觸酶反應(yīng)均呈陽(yáng)性。根據(jù)上述特征，初步判斷SM905為芽胞桿菌屬。

圖1 SM905桿狀體（A）、孢囊體（B）、芽胞（C）形態(tài)（100×）Fig. 1 Rod-shaped strain(A), sporangium (B) and spore(C)morphology of strain SM905 (100×)

2.1.2 16S rDNA和gyrB 序列分析 菌株SM905的16S rDNA和gyrB序列Genbank號(hào)分別為OM021868和OM037015，并與相關(guān)屬種進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可以看出，菌株SM905與貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis的模式菌株BCRC 17467聚合在一枝，同源性達(dá)99%以上。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將菌株SM905鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 菌株SM905基于16S rDNA（A）和gyrB（B）序列的進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic trees of strain SM905 based on sequences of 16S rDNA (A) andgyrB (B)

2.2 菌株SM905對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用

2.2.1 對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性 從圖3可知，SM905對(duì)鐵皮石斛炭疽病菌有較強(qiáng)的抑菌活性，形成了明顯的抑菌帶，界限邊緣整齊，靠近抑菌帶邊緣菌絲稀疏并顏色加深。

圖3 SM905對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性Fig. 3 Antifungal activity of SM905 againstColletotrichum gloeosporioides

2.2.2 對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)的影響 與對(duì)照相比，不同稀釋倍數(shù)的 SM905發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)率與對(duì)照相比差異不顯著（表1）。從形態(tài)上觀察，SM905發(fā)酵上清液對(duì)新萌發(fā)菌絲生長(zhǎng)抑制明顯，表現(xiàn)為菌絲粗細(xì)不一，分支少，菌絲中部有明顯的膨大，而對(duì)照組菌絲粗細(xì)均勻、舒展，分支多，呈大網(wǎng)狀（圖4）。表明SM905發(fā)酵過程中產(chǎn)生了含有抗膠孢炭疽菌的活性物質(zhì)，能顯著抑制其孢子萌發(fā)后新菌絲的生長(zhǎng)。

表1 SM905發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of strain SM905 fermentation filtrate on spore germination and mycelial growth ofC.gloeosporioides

圖4 SM905對(duì)膠孢炭疽菌孢子新萌發(fā)菌絲的影響(400X)Fig. 4 Effect of SM905 against the newly germinated mycelium ofC. gloeosporioides(400X)

2.2.3 對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響 從表1可以看出，SM905發(fā)酵上清液不同稀釋倍數(shù)對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率存在極顯著差異（P＜0.01），隨著稀釋倍數(shù)增大，抑制效果逐漸下降（表1）。SM905發(fā)酵上清液 20倍稀釋液對(duì)膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率仍大于90%，通過光學(xué)顯微鏡觀察到該濃度處理組氣生菌絲粗細(xì)不一、盤曲折疊，隔膜之間菌絲縮短，菌絲膨大，大量色素積累；基部菌絲產(chǎn)生大量分生孢子。而對(duì)照組膠孢炭疽菌菌絲均勻、光滑、粗壯，菌絲內(nèi)無色素積累現(xiàn)象，無分生孢子產(chǎn)生。進(jìn)一步通過掃描電鏡觀察到處理組菌絲出現(xiàn)大量空洞，菌絲斷裂現(xiàn)象明顯，證實(shí)了SM905對(duì)膠孢炭疽菌菌絲的破壞作用（圖5）。

圖5 SM905對(duì)膠孢炭疽菌菌絲形態(tài)的影響Fig. 5 The effect of strain SM905 on mycelial morphology ofC. gloosporioides

2.3 菌株SM905防治鐵皮石斛炭疽病盆栽試驗(yàn)

由盆栽試驗(yàn)結(jié)果(表2)可以看出，人工接種病原菌后，對(duì)照組開始陸續(xù)發(fā)病，30 d時(shí)病情指數(shù)為15.78。SM905粉劑100倍液間隔7 d噴施2次，藥后15 d對(duì)鐵皮石斛炭疽病的防效達(dá)83.96%，與噴施1次的防效（55.36%）差異極顯著，但低于10%苯醚甲環(huán)唑800倍液（85.4%）；30 d時(shí)防效仍保持在80%，優(yōu)于10%苯醚甲環(huán)唑800倍液（79.28%），顯著優(yōu)于SM905噴施1次防效（50.70%）。表明SM905防治鐵皮石斛炭疽病應(yīng)選擇發(fā)病初期用藥，并且連續(xù)用2次防效更好，持效期更長(zhǎng)。

表2 SM905粉劑防治鐵皮石斛炭疽病的盆栽試驗(yàn)Table 2 Control efficacy of strain SM905 onDendrobiumbium officinaleanthracnose

3 討論

鐵皮石斛是名貴中藥材，炭疽病是影響其品質(zhì)和產(chǎn)量的重要病害之一。研制安全、高效的生物農(nóng)藥，對(duì)于保障鐵皮石斛質(zhì)量安全，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要的研究意義及廣闊的應(yīng)用前景。貝萊斯芽胞桿菌屬于芽胞桿菌屬，該菌首次發(fā)現(xiàn)于西班牙馬拉加的一條名為貝萊斯河的河口。研究表明貝萊斯芽胞桿菌對(duì)引起稻瘟病、梨灰霉病、草莓炭疽病、小麥赤霉病等病害的多種植物病原菌具有抑制作用[15-18]，在生物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛能。貝萊斯芽胞桿菌對(duì)鐵皮石斛炭疽病的研究局限于實(shí)驗(yàn)室拮抗菌的分離篩選階段。所篩菌株僅在室內(nèi)中表現(xiàn)出拮抗作用還是不夠的，只有在應(yīng)用中依舊表現(xiàn)出良好防效的拮抗菌株，才具有生防應(yīng)用潛力[19]。本研究篩選到一株貝萊斯芽胞桿菌SM905，平板對(duì)峙試驗(yàn)表明該菌對(duì)鐵皮石斛膠孢炭疽菌具有較強(qiáng)的抑制活性。本研究還進(jìn)一步展開了 SM905對(duì)鐵皮石斛炭疽病的盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果表明SM905粉劑100倍液對(duì)炭疽病的防效達(dá)80%以上，優(yōu)于10%苯醚甲環(huán)唑800倍液，本說明該菌株具有較強(qiáng)的開發(fā)前景。

各生防菌株的來源不同，產(chǎn)生的拮抗活性物質(zhì)類型不同，其作用機(jī)理也有所差異[20]，作用機(jī)理的研究對(duì)建立田間使用技術(shù)十分關(guān)鍵。以往研究表明貝萊斯芽胞桿菌的抑菌機(jī)理為致使病原菌菌絲畸形和降低孢子萌發(fā)率[21-24]，相比之下本研究菌株SM905在機(jī)理上有兩個(gè)不同點(diǎn)。SM905僅抑制膠孢炭疽菌孢子萌發(fā)后新菌絲的生長(zhǎng)，對(duì)孢子萌發(fā)率本身沒有顯著影響；SM905發(fā)酵上清液 20倍稀釋液能抑制膠孢炭疽菌氣生菌絲的生長(zhǎng)，使其膨大畸形、空洞，甚至斷裂，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)病原菌基部菌絲在3 d內(nèi)產(chǎn)生大量分生孢子，而對(duì)照組菌絲培養(yǎng)10 d后才開始形成明顯的分生孢子堆，說明SM905發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì)脅迫了病原菌菌絲的生長(zhǎng)，加速其老化產(chǎn)孢。分生孢子可以在不良環(huán)境中休眠，如條件合適，則繼續(xù)萌發(fā)生長(zhǎng)，侵染植物。因此在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)選擇發(fā)病初期施藥，同時(shí)保證足夠的藥劑濃度，或者通過重復(fù)施藥，以達(dá)到徹底殺滅病原菌菌絲的目的，這一點(diǎn)與盆栽試驗(yàn)結(jié)果吻合。SM905粉劑100倍液施用2次效果優(yōu)于1次。在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)一步開展SM905的發(fā)酵工藝研究、活性物質(zhì)的分離鑒定以及田間應(yīng)用技術(shù)研究，希望能為鐵皮石斛的安全生產(chǎn)提供一種新型高效的生防制劑。