王海霞,鄭成忠,東保柱,孟煥文,周洪友*,孫瑞鋒,鄭紅麗*
(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院/生物農(nóng)藥創(chuàng)制與資源利用自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育),呼和浩特 010019;2. 烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院,集寧 012000;3. 鄂爾多斯市萬通農(nóng)牧業(yè)科技有限公司,鄂爾多斯 017000)
燕麥Avena sativa在我國種植歷史悠久,屬禾本科Gramineae燕麥屬Avena植物,是一種糧飼兼用作物,同時(shí)也是一種功能性保健食品[1]。燕麥多生長在高寒、貧瘠和干旱的極端環(huán)境中,已經(jīng)成為生態(tài)脆弱區(qū)不可替代的特色糧飼作物[2]。因?yàn)檠帑湢I養(yǎng)價(jià)值高及適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn),種植面積逐年擴(kuò)大,現(xiàn)已成為北方地區(qū)著力發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)。但燕麥生產(chǎn)也存在產(chǎn)量低、田間病蟲害發(fā)生頻繁等問題[3]。燕麥田常見病害有炭疽病、德式霉葉斑病、紅葉病、黑穗病等[4];影響燕麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。鑒于國家當(dāng)前的農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、發(fā)展草牧業(yè)、生態(tài)環(huán)境建設(shè)等一系列政策措施的支持,燕麥作為一種優(yōu)良的糧飼兼用作物,其集約化的種植面積將會(huì)逐年增加,勢(shì)必會(huì)引起病害的普遍發(fā)生和嚴(yán)重危害。因此,燕麥生產(chǎn)中有害生物的綠色防控成為燕麥產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的必由之路[4]。
植物內(nèi)生菌是非常重要的微生物資源,現(xiàn)已成為植物學(xué)、微生物學(xué)、植物保護(hù)學(xué)及作物育種學(xué)等多種學(xué)科研究的熱點(diǎn)[5-7]。植物內(nèi)生菌對(duì)于植物有促生、誘導(dǎo)植物抗病性、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、生物固氮、降解有害物質(zhì)等作用[8-10],是重要的生防資源。研究表明,短葉紅杉Taxus revifolia的韌皮部分離出的一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌——安德烈紫杉菌Taxomyces andreanae,能夠提高短葉紅衫的抗病性[11];內(nèi)生菌通過影響宿主植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝促進(jìn)宿主植物的生長[12]。Mal1nowski等[13]發(fā)現(xiàn)感染了內(nèi)生真菌的酥油草其根系具有更強(qiáng)的吸收P的能力, 同時(shí)根系內(nèi)Ca、Mg含量也較高, 其機(jī)制可能是增加根系長度和向土壤中分泌酸類。史應(yīng)武等[14]發(fā)現(xiàn)從甜菜根部分離的1株內(nèi)生菌能顯著增加甜菜鮮重、葉綠素含量及含糖率,有明顯的促生、增糖作用。內(nèi)生菌還可以通過分泌植物生長素(Indole acetic acid)、赤霉素(Gibberellin A4)和細(xì)胞分裂素(Cytokinin)等植物激素直接促進(jìn)植物生長。如沈德龍等[15]從水稻中分離到的內(nèi)生成團(tuán)泛菌YS19可以分泌生長素、細(xì)胞脫落酸、赤霉素和細(xì)胞分裂素4種植物激素。目前,很多研究人員開始致力于植物體內(nèi)的細(xì)菌研究,至今在植物保護(hù)方面積累了大量的植物內(nèi)生細(xì)菌研究信息[16,17]。但是,針對(duì)燕麥的內(nèi)生菌的研究卻鮮有報(bào)道。
本研究通過對(duì)田間長勢(shì)良好的燕麥植株的內(nèi)生菌進(jìn)行分離、鑒定和生物測定;以期獲得對(duì)燕麥有促生、防病作用的內(nèi)生菌;為燕麥病害的綠色防控積累重要生物資源,并為進(jìn)一步深入了解燕麥內(nèi)生菌促生及防病機(jī)制及應(yīng)用于燕麥生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
供試樣品:分離燕麥植株來自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市、河北省張家口市、云南省會(huì)澤等地,具體信息如表1。
表1 燕麥樣本來源及分離數(shù)量Table 1 Oat sample source and separation results
供試病原:燕麥葉斑病菌Drechslera avenae、燕麥炭疽病菌Colletotrichum graminicola、馬鈴薯黃萎病菌Verticillium dahliae、馬鈴薯枯萎病菌Fusarium oxysporum、馬鈴薯黑痣病菌Rhizoctonia solani、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室分離、保存。
供試培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g,切塊煮沸30 min,濾液中加葡萄糖20 g,瓊脂18 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH自然。LB培養(yǎng)基:酵母膏5~10 g,氯化鈉5 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH 7.0~7.2。LB液體培養(yǎng)基:酵母膏5~10 g,氯化鈉5 g,蛋白胨10 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH 7.0~7.2。PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.2 g,KCl 0.2 g,Ca3(PO4)25.0 g,MgSO4·7H2O 0.03 g,MnSO40.03 g,F(xiàn)eSO40.003 g,酵母膏0.5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 L,pH 6.8~7.0,121 ℃滅菌30 min。鉀長石培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,鉀長石2.5 g,Na2HPO40.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,NaCl 0.2 g,CaCO35.0 g,CaSO4·7H2O 0.1 g,瓊脂 20 g,pH 7.0。king B 培養(yǎng)基:蛋白胨 20 g,磷酸氫二鉀1.5 g,七水合硫酸鎂1.5 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH 7.0~7.2。DF培養(yǎng)基KH2PO44 g,Na2HPO46 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,葡萄糖2 g,葡萄糖酸鈉2 g,檸檬酸2 g,(NH4)2SO42 g,組分一(H3BO310 mg,MnSO4·H2O 11.19 mg,ZnSO4·7H2O 124.6 mg,CuSO4·5H2O 78.22 mg,MoO310 mg,溶于 100 mL 滅菌蒸餾水中,4 ℃保存),組分二(FeSO4·7H2O 100 mg溶于10 mL滅菌蒸餾水中,4 ℃保存)溶液各0.1 mL,蒸餾水定容至1000 mL,pH 7.2。ADF培養(yǎng)基:ACC(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸)溶于超純水后抽濾滅菌,加到不含(NH4)2SO4且預(yù)先滅菌的DF培養(yǎng)基中,ACC終濃度為3 mmol/L。Salkowski比色液:稱取硫酸鐵12 g溶于蒸餾水中,之后緩慢加入429.7 mL濃硫酸,待溶液冷卻后定用蒸餾水容至1 L。測定范圍為0.3~20 mg/mL。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,天津,中國)16S rDNA擴(kuò)增引物:27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')、1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')gyrA 基因擴(kuò)增引物:gyrA-F(5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3')、gyrA-R(5'-CAAGGTAATGCTCCAGGC ATTGCT-3'),增試劑:2×mixTaq酶、瓊脂粉、核酸染料。
健康的燕麥植株沖洗干凈,然后依次用75%乙醇浸泡30 s,5%次氯酸鈉浸泡2 min,無菌水沖洗3次。樣品經(jīng)表面消毒后,將根、莖、葉用無菌剪刀剪成小段,放入研缽中研磨至勻漿。將梯度稀釋后的勻漿均勻涂布于固體 LB,同時(shí)取最后一次無菌水沖洗液,涂布至空白平板上,培養(yǎng)觀察。如無菌落長出,說明植物組織的表面消毒徹底,分離出來的即為植物內(nèi)生菌。培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)48 h后,挑取不同形態(tài)的菌落用30%甘油在-80 ℃冰箱保存。
利用平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選病原菌的拮抗內(nèi)生菌[18]。首先在PDA培養(yǎng)基中心接種直徑0.5 cm的病原菌菌餅,然后在病原菌菌餅等距離(2.5 cm)處點(diǎn)接分離得到的細(xì)菌菌株,以僅在中心接種病原菌的平板作為對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)3~6 d后,觀察結(jié)果。以抑菌圈的大小和形狀判斷拮抗程度。抑菌率(%)=(對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/(對(duì)照菌落半徑-0.25 cm)×100。
1.4.1 防病效果測定 燕麥離體葉片置于鋪有2 層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,將1×107cfu/mL菌懸液均勻噴霧于葉片表面。在葉片上接種10 mL孢子濃度為1×107cfu/mL 的炭疽菌孢子懸浮液。最后,將培養(yǎng)皿置于16 h光照/8 h黑暗、25 ℃條件下培養(yǎng)4 d。測量病斑長度,并計(jì)算防治效果。防治效果(%)=(對(duì)照病斑直徑-處理病斑直徑)/對(duì)照病斑直徑×100。
1.4.2 促生作用測定 種植燕麥的土壤進(jìn)行高溫滅菌,按照土壤、蛭石、營養(yǎng)土體積比 2:2:1進(jìn)行混合,裝盆待用。將燕麥種子沖洗干凈,然后依次用5%次氯酸鈉浸泡3 min,無菌水沖洗4次。之后將燕麥種子放入待測菌株菌懸液中,在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 h,以在液體LB中搖培2 h的燕麥種子設(shè)為對(duì)照。將處理好的燕麥種子均勻地撒在花盆中,每盆20粒,重復(fù)3次,表面覆土,于培養(yǎng)室內(nèi)(25 ℃)培養(yǎng),隔天澆水。待生長3 周后測量植株出苗率、株高、鮮重等,分析不同內(nèi)生細(xì)菌對(duì)燕麥生長的影響。
田間試驗(yàn)地塊設(shè)置在內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市集寧區(qū)烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院和內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市武川縣小西攤村兩處。試驗(yàn)于2021年5月至9月進(jìn)行,兩個(gè)地點(diǎn)處理相同,每個(gè)地點(diǎn)設(shè)置內(nèi)生菌處理和空白對(duì)照,重復(fù)4次。燕麥種子的品種為白燕二號(hào),首先用內(nèi)生菌菌懸液(1×107cfu/mL)對(duì)燕麥種子進(jìn)行拌種,待晾干后播種。之后每隔20 d左右對(duì)燕麥植株進(jìn)行內(nèi)生菌菌懸液噴霧,共進(jìn)行3次。其中菌懸液(1×107cfu/mL)需稀釋10 倍后施用,對(duì)照只噴霧清水,田間常規(guī)管理。
待對(duì)照發(fā)病后開始調(diào)查,每個(gè)小區(qū)隨機(jī)調(diào)查燕麥植株炭疽病發(fā)病情況,燕麥炭疽病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):按病斑所占葉片表面積進(jìn)行分級(jí),1級(jí):無病斑;2級(jí):1%~10%;3級(jí):11%~25%;4級(jí):26%~50%;5級(jí):51%以上。病情指數(shù)=100×∑(各級(jí)病葉數(shù)×該病級(jí)代表相數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值),防治效果(%)=100×(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)。并調(diào)查了燕麥植株的株高,與對(duì)照相比,計(jì)算處理對(duì)燕麥植株的促生作用。
1.6.1 解磷能力測定 將內(nèi)生菌接種于PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基平板上,3次重復(fù),30 ℃下培養(yǎng)3 d,觀察菌落周圍是否有解磷圈的形成及其直徑大小,以此來判斷該菌株有無解磷能力,并測量解磷圈直徑及菌落直徑,解磷能力的大小用解磷圈直徑/菌落直徑(D/d)表示,其比值越大,解磷效果越好,以此來初步確定菌株的解磷能力[19]。
1.6.2 解鉀能力測定 將菌株接種于鉀長石培養(yǎng)基平板上,3次重復(fù),28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落周圍是否有解鉀圈的形成及其直徑大小,以此來判斷該菌株有無解鉀能力,并測量解鉀圈直徑及菌落直徑,解鉀能力的大小用解鉀圈直徑/菌落直徑(D/d)表示,其比值越大,解鉀效果越好,以此來初步確定菌株的解鉀能力[20]。
1.6.3 產(chǎn)吲哚乙酸IAA能力測定 選用經(jīng)典的 Salkowski試劑比色法[21]。挑取待篩選菌株單菌落接入液體LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600=1。將菌懸液以1%的接種量接至不含色氨酸的King B培養(yǎng)基中,以無菌水做對(duì)照。將上述三角瓶置于28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。取菌懸液1 mL滴加于試管中,加入等量的Salkowski比色液,將試管置于室溫顯色15 min,觀察顏色變化,將比色結(jié)果與IAA以及加無菌水的不含色氨酸的king B培養(yǎng)基做對(duì)照,溶液顏色越紅,表明IAA生產(chǎn)能力越強(qiáng),不變色則為陰性,不產(chǎn)IAA。
1.6.4 產(chǎn)ACC脫氨酶能力測定 挑取產(chǎn)IAA陽性菌株少許于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中,將三角瓶置于28 ℃、180 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,制成菌懸液。吸取200 μL上述菌懸液加入到提前配置好的10 mL的DF培養(yǎng)基中,在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,吸取200 μL加入到10 mL的ADF培養(yǎng)基中,在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,將菌株再在ADF培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接培養(yǎng)一次。以ADF(不含ACC)培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照,不接菌的ADF和不含ACC的ADF培養(yǎng)基調(diào)零,在分光光度計(jì)下測量其在600 nm波長下的光度值,菌液濃度OD600大于0.1,表明菌株能夠利用 1-氨基環(huán)丙烷羧酸(ACC)作為唯一氮源生長,初步認(rèn)為是ACC脫氨酶陽性菌株。
1.7.1 形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定 對(duì)待鑒定菌株YN-J3利用革蘭氏染色進(jìn)行初步鑒定[22],參照方中達(dá)《植物病理研究方法》[23]進(jìn)行生理生化鑒定。
1.7.2 分子生物學(xué)鑒定 挑取單菌落于1.5 mL離心管中,12000 r/min離心1 min,收集菌體。細(xì)菌DNA由購自天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取,詳細(xì)步驟請(qǐng)參閱產(chǎn)品手冊(cè)。
用通用引物 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')、1492R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGAC TT-3')擴(kuò)增 16S rDNA,并利用引物gyrA-F(5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3')、gyrA-R(5'-CAA GGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3')擴(kuò)增看家基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL,其中DNA模板為3 μL,27F/1492R引物各1 μL,2×mixTaq酶12.5 μL,ddH2O 7.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min、30個(gè)循環(huán),最后72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送到北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。將測序的結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序進(jìn)行相似性比對(duì)分析。用MEGA 7.0構(gòu)建目標(biāo)菌株16S rDNA與gyrA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。
本試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Excel軟件上進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)算結(jié)果在SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件上完成,檢驗(yàn)處理間的差異顯著性。
通過對(duì)來自內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北省及云南省等地點(diǎn)的健康燕麥植株樣本進(jìn)行內(nèi)生菌分離(表1),共分離到512株內(nèi)生菌。其中,對(duì)于燕麥德式霉菌有抑制作用的共122株,有9株內(nèi)生細(xì)菌的抑制率達(dá)到60%以上,分別為JN-Y2、XH-J8、JN-G7、JN-J12、YN-J3、ZZ-J4、ZZ-G2、ZZ-G5、ZZ-J3(表2)。其中菌株YN-J3抑制效果最好,抑菌率為79.03%(圖1)。篩選出的9 株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)燕麥炭疽病菌均有不同程度的抑菌作用,菌株YN-J3的抑菌率為89.60%(表2)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明,篩選得到的9株燕麥內(nèi)生菌對(duì)于燕麥2種病原菌均有廣譜的抑菌效果,菌株YN-J3的抑菌效果最顯著。
表2 內(nèi)生菌對(duì)燕麥病菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of endophytes on oat disease bacteria
圖1 內(nèi)生菌對(duì)燕麥葉斑病菌的拮抗作用Fig. 1 The antagonistic effect of endophytes on oat leaf spotpathogen
將分離得到的9株燕麥內(nèi)生菌與馬鈴薯常見病原菌做平板對(duì)峙試驗(yàn),結(jié)果表明:9株燕麥內(nèi)生菌均能抑制馬鈴薯黑痣病菌、菌核病菌、鐮刀菌病菌、大麗輪枝菌的生長。因此,9株燕麥內(nèi)生細(xì)菌對(duì)于馬鈴薯、燕麥常見病原菌具有廣譜抑制作用,菌株YN-J3對(duì)4種馬鈴薯病原菌均有很好的抑制作用,抑制率分別為80.66%、65.06%、68.98%和89.28%(表3)。
表3 內(nèi)生菌對(duì)其他病原真菌的抑制作用Table 3 Inhibition of endophytes on other pathogenic fungi
利用離體接種的方法,測定菌株YN-J3對(duì)燕麥炭疽病的室內(nèi)防治效果。結(jié)果如圖2所示,YN-J3處理后炭疽病斑長度為(0.23±0.03)cm,對(duì)照的病斑長度為(0.93±0.03)cm。離體條件下,YN-J3的防治效果為75.27%。此外,接種4 d后,對(duì)照葉片已退綠,經(jīng)菌株YN-J3處理后的葉片仍為綠色。結(jié)果表明,菌株YN-J3離體條件下能夠有效控制炭疽病的侵染和擴(kuò)展。
圖2 菌株YN-J3對(duì)燕麥炭疽病菌的離體葉片試驗(yàn)Fig. 2 Test of detached leaves of strain YN-J3 against the pathogen of oat anthracnose
試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示,與對(duì)照組相比,菌株YN-J3處理與對(duì)照的鮮重分別為(5.36±0.57)和(3.63±0.49)g,YN-J3處理比對(duì)照增加了47.66%;干重分別為(0.72±0.04)和(0.31±0.03)g,YN-J3處理比對(duì)照增加了83.87%;株高分別為(35.27±0.77)和(28.25±1.88)cm,YN-J3處理比對(duì)照增加了24.84%。結(jié)果表明,菌株YN-J3對(duì)燕麥有很好的促生作用。
圖3 內(nèi)生菌對(duì)燕麥生長的影響Fig. 3 Effect of bacterial strain on the growth of oat
通過兩個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行燕麥株高分析,與對(duì)照相比,集寧和武川兩個(gè)地點(diǎn)經(jīng)菌株YN-J3處理的燕麥株高均顯著高于對(duì)照。如圖4所示,集寧地點(diǎn)的菌株YN-J3處理與對(duì)照的株高分別為(120.88±6.98)和(99.01±4.67)cm,YN-J3處理比對(duì)照增加了22.09%;武川地點(diǎn)的菌株YN-J3處理與對(duì)照的株高分別為(59.39±1.39)和(48.03±1.49)cm,YN-J3處理比對(duì)照增加了23.65%。
圖4 內(nèi)生菌YN-J3對(duì)燕麥株高的影響(田間)Fig. 4 Effects of endophytes on oat plant height (Field)
通過兩個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行田間防效分析,與對(duì)照相比,經(jīng)菌株YN-J3處理的燕麥炭疽病發(fā)病率明顯低于對(duì)照。如表4所示,集寧地點(diǎn)的菌株處理與對(duì)照的發(fā)病率分別為(8.31±0.26)%、(19.08±1.03)%,其防治效果為74.53%;武川地點(diǎn)的菌株YN-J3處理與對(duì)照的發(fā)病率分別為(26.28±3.14)%、(47.30±3.62)%,其防治效果為63.57%。結(jié)果表明,菌株YN-J3在田間條件下具有較強(qiáng)抑菌活性。
表4 菌株YN-J3對(duì)燕麥炭疽病的田間防效作用Fig. 4 Field control effect of strain YN-J3 on oat anthracnose
為了研究菌株YN-J3的促生機(jī)制,對(duì)菌株YN-J3解磷、解鉀、產(chǎn)IAA和產(chǎn)ACC脫氨酶能力進(jìn)行測定。解磷能力測定結(jié)果如圖5所示:菌株YN-J3有非常明顯的解磷圈,無機(jī)磷培養(yǎng)基上解磷圈直徑/菌落直徑(D/d)為(1.80±0.04),表明其具有解磷作用(表5);將內(nèi)生菌接種于鉀長石培養(yǎng)基上,觀察其解鉀圈的直徑大小,結(jié)果表明菌株 YN-J3周圍有明顯的解鉀圈(圖5),其解鉀圈直徑/菌落直徑(D/d)為(2.28±0.05),試驗(yàn)表明菌株YN-J3具有解鉀作用(表5)。產(chǎn) IAA試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,菌株YN-J3紅色最深,并進(jìn)行了IAA的定量測定,結(jié)果表明菌株YN-J3分泌IAA量最多,為(24.20±0.01)μg/mL,表明其產(chǎn)IAA能力最強(qiáng)。對(duì)菌株YN-J3進(jìn)行產(chǎn)ACC脫氨酶OD值為0.18,大于 0.1,表明菌株 YN-J3有一定程度的產(chǎn) ACC脫氨酶能力(表5)。
表5 內(nèi)生菌YN-J3 解磷、解鉀及產(chǎn)ACC脫氨酶能力Table 5 Endophyte YN-J3 dissolves phosphorus, potassium and ACC deaminase
圖5 內(nèi)生菌YN-J3的解磷及解鉀測試結(jié)果Fig. 5 Endophyte YN-J3s test results of dissolving phosphorus and potassium
圖6 內(nèi)生菌株 YN-J3 產(chǎn)IAA顯色結(jié)果Fig. 6 Endophytic strain YN-J3 produced IAA color development results
2.5.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定 對(duì)篩選出拮抗效果較好的菌株YN-J3進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定,結(jié)果表明,菌株YN-J3白色,菌落不透明,表面粗糙有隆起,邊緣不規(guī)則(圖7)。經(jīng)鑒定,其革蘭氏染色結(jié)果為陽性(圖8),甲基紅試驗(yàn)、丙二酸鹽試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)均為陽性反應(yīng),V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)為陰性反應(yīng)(表6)。菌體(0.70~0.90)μm×(1.80~3.00)μm;YN-J3在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2~3 d產(chǎn)生芽胞,芽胞中生,產(chǎn)生芽胞后菌體膨大(圖8)。
表6 促生菌株生理生化鑒定Table 6 physiological and biochemical identification results of growth promoting
圖7 內(nèi)生菌株YN-J3菌落形態(tài)Fig. 7 Colony morphology of endophytic strain YN-J3
圖8 內(nèi)生菌株YN-J3革蘭氏染色結(jié)果Fig. 8 Endophytic strain YN-J3 gram staining results
2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 利用27F/1492R引物對(duì)擴(kuò)增16S rDNA,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析,在1500 bp左右得到清晰明亮的特異性條帶(圖9)。對(duì)特異性條帶測序,將獲得的序列在NCBI中Blast同源性比對(duì),菌株YN-J3與解淀粉芽胞桿菌B. amyloliquefaciens相似度為99.93%,且菌株YN-J3的gyrA基因序列與解淀粉芽胞桿菌相似度為99.86%,下載同源序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果如圖10所示:菌株YN-J3與解淀粉芽胞桿菌MW559233.1聚為一類。結(jié)果表明,菌株YN-J3為解淀粉芽胞桿菌,16S rDNA基因序列登錄號(hào)為OL872222。
圖9 菌株YN-J3的16S rDNA及gyrA基因PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 9 PCR amplification electrophoresis of 16S rDNA andgyrA gene of strain YN-J3
圖10 菌株YN-J3基于多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 10 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain YN-J3
內(nèi)生菌物種豐富,主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌三大類,為生物農(nóng)藥、肥料開發(fā)提供了巨大的資源庫[24]。植物內(nèi)生菌種類多樣性取決于自身和寄主種類多樣性,以及寄主不同部位分布的可選性[25]。目前世界報(bào)道的原料研究對(duì)象中,植物內(nèi)生細(xì)菌多為Bacillus、Pseudomonas等,存在于至少129種大田作物及工業(yè)原料作物中[26]。本研究通過對(duì)燕麥內(nèi)生菌進(jìn)行分離,得到了512株內(nèi)生細(xì)菌,細(xì)菌形態(tài)多樣;通過16S rDNA擴(kuò)增序列分析結(jié)果表明,512株細(xì)菌中涉及到了芽胞桿菌等多個(gè)屬內(nèi)的6個(gè)種。512株細(xì)菌中有9株對(duì)于燕麥葉斑病、炭疽病菌有很強(qiáng)的抑菌效果。以上研究結(jié)果表明:燕麥的內(nèi)生菌種類豐富,是重要的生防資源。
枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌具有良好的定殖能力,能保護(hù)植物免受病原真菌的侵害[27],還有促生長的作用[28]。研究表明:抗生作用是芽胞桿菌主要的生防機(jī)制之一[29,30]。如解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7對(duì)9株植物病原真菌均具有良好的拮抗效果[31];枯草芽胞桿菌B. subtilisRSS-55對(duì)油菜菌核病菌S. sclerotiorum有極強(qiáng)的抑制效果,抑制率高達(dá) 93.33%[32]。此外,芽胞桿菌還可以分泌出磷酸脂酶和嗜鐵素,從而吸收利用土壤中的難溶性磷和固態(tài)鐵[33,34];也有一些芽胞桿菌能夠分泌植物生長類激素,促進(jìn)植物生長。本研究中,分離自燕麥的B. amyloliquefaciensYN-J3能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì),顯著抑制燕麥病原菌的生長;并且通過解磷、解鉀、產(chǎn)生植物生長激素等方式,促進(jìn)燕麥生長。以上結(jié)果表明:燕麥內(nèi)生芽胞桿菌資源在防控植物病害、促進(jìn)植物生長等方面發(fā)揮重要作用,是值得開發(fā)利用的生防資源。
在內(nèi)蒙古地區(qū),馬鈴薯常年連作,會(huì)導(dǎo)致土壤養(yǎng)分利用嚴(yán)重失衡,土傳病害日益加重[35]。燕麥-馬鈴薯輪作是合理利用土壤肥力,減輕馬鈴薯土傳病害的重要農(nóng)業(yè)措施;這種輪作的方式也是內(nèi)蒙古寒旱區(qū)主要的種植模式[36]。本研究發(fā)現(xiàn),分離得到的多株燕麥內(nèi)生菌,具有廣譜抗菌活性,對(duì)于馬鈴薯土傳病原菌有拮抗作用。燕麥內(nèi)生菌有望用于防治馬鈴薯土傳病害,其防治效果需要進(jìn)一步研究確定。