葛銀銀，王 濱

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學微生物防治省重點實驗室，合肥 230036；2.安徽省黃山市黃山區(qū)林業(yè)局，黃山 242700）

棉蚜Aphisgossypii，是一種世界分布的經(jīng)濟害蟲，其年發(fā)生代數(shù)多, 繁殖力強，是棉花、瓜類、洋麻等多種作物上的重要害蟲之一[1]。防治上主要依賴于化學防治，目前對氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、有機磷、有機氯、新煙堿類等多種殺蟲藥劑已經(jīng)產(chǎn)生了抗性[2]，化學農(nóng)藥的使用不僅嚴重污染環(huán)境，而且對草蛉類和瓢蟲類等天敵昆蟲種群動態(tài)有較大影響[3]，生態(tài)環(huán)境遭到破壞的同時也威脅到人類的健康。

昆蟲病原真菌因為具有直接從昆蟲體壁侵入殺死害蟲的獨特致病機理，而成為化學農(nóng)藥替代品的首選微生物農(nóng)藥[4]。目前在害蟲防治研究中涉及最多的昆蟲病原真菌種類是蟲草屬和白僵菌屬真菌，其中玫煙色蟲草Cordyceps（=Isaria）fumosorosea和球孢白僵菌Beauveriabassiana就是很好的生防菌，玫煙色蟲草舊稱玫煙色擬青霉Paecilomycesfumosoroseus，后來移入棒束孢屬Isaria[5]，玫煙色蟲草寄主范圍廣，包括半翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等8目[6]，能侵染桃小綠葉蟬Empoascaflavescens、棉蚜、煙粉虱Bemisiatabaci、桃蚜Myzuspersicae、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、菜青蟲Pierisrapae、柑橘粉蚧Planococcuscitri等40多種昆蟲[7-9]，尤其對刺吸式口器害蟲有很高的致病力[10]。球孢白僵菌在我國20世紀50年代開始研究，至今有70年左右的歷史[11]，作為生物農(nóng)藥大規(guī)模生產(chǎn)和使用也有50余年歷史。球孢白僵菌作為環(huán)境友好的真菌殺蟲劑在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用[12-14]。

球孢白僵菌和玫煙色蟲草等昆蟲病原真菌的孢子萌發(fā)與致病性往往受到環(huán)境因子，尤其是濕度因子的影響[15]。很多研究證實，環(huán)境濕度過低會影響昆蟲病原真菌對害蟲的侵染，降低田間防治效果[16]，而高濕環(huán)境則可以取得良好的防治效果[17-19]。這意味著調(diào)節(jié)田間應(yīng)用的環(huán)境濕度可能會直接影響到昆蟲病原真菌對害蟲的防治效果。

本研究在應(yīng)用球孢白僵菌Bb202和玫煙色蟲草Ifu13a噴霧防治棉蚜后，通過人工噴灑水霧的方法增加環(huán)境相對濕度，研究在環(huán)境濕度調(diào)節(jié)下，這兩種昆蟲病原真菌在不同應(yīng)用劑量下對環(huán)境濕度變化的響應(yīng)及對目標害蟲棉蚜防治效果的影響，研究將為真菌生物農(nóng)藥田間濕度調(diào)控的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗器材

試驗中所使用的器材見表1。

表1 本試驗所用到的主要器材Table 1 Main equipment used in this experiment

1.2 供試菌株

球孢白僵菌Bb202原寄主為鞘翅目天牛，玫煙色蟲草Ifu13a原寄主為半翅目粉虱，兩種菌株都保存于安徽農(nóng)業(yè)大學微生物防治省重點實驗室RCEF菌種庫。

1.3 供試菌株孢子懸浮液的制備

將4 ℃冰箱保存的球孢白僵菌Bb202和玫煙色蟲草Ifu13a按照王濱等[20]孢子懸浮液制備方法進行菌株培養(yǎng)、孢子收集與孢子懸浮液制備。最終制成1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL濃度的孢子懸浮液用于后續(xù)的蚜蟲田間防治。

1.4 試驗地設(shè)置

試驗設(shè)置在安徽農(nóng)業(yè)大學植物園海桐板塊區(qū)，試驗前對海桐定期澆水以確保植物生長良好。每個試驗處理區(qū)的海桐面積約12 m2（長4.0 m×寬3.0 m）。施藥之前，按對角線取樣方法，隨機挑選3棵海桐；每棵海桐按不同方位選取蟲口密度比較均勻的枝條作為取樣枝條，并用毛筆將枝上的吹綿蚧、螞蟻、瓢甲等其他昆蟲進行完全清理，僅保留蚜蟲進行防效調(diào)查，每個樣枝掛上標簽并記錄時間與蟲口基數(shù)。

1.5 菌株的田間應(yīng)用濃度與濕度調(diào)控設(shè)計

1.5.1 田間應(yīng)用濃度 球孢白僵菌和玫煙色蟲草均設(shè)置1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL 3個孢懸液濃度處理組及0.05% Tween-80空白對照。

1.5.2 環(huán)境濕度調(diào)節(jié) 在田間噴霧防治后的第2 d、第3 d，用超低量噴霧器每天3次對防治區(qū)濕度調(diào)控處理組的海桐冠層進行補濕噴霧，以提高植物冠層的相對濕度。相對濕度數(shù)值由置于冠層的便攜式濕度計測定。非濕度調(diào)節(jié)處理組則保持自然環(huán)境狀態(tài)。每個菌株3個濃度，共8個處理。每處理3次重復。

1.6 田間噴藥防治與田間濕度調(diào)控

2018年9月10日、2018年10月1日、2019年3月13日和2018年9月22日、2018年10月23日、2019年3月19日，在試驗地分別進行了3次球孢白僵菌和3次玫煙色蟲草防治棉蚜的田間防治試驗。孢子懸浮液采用背負式超低量噴霧器（Evivk，UK）進行噴霧施藥。作業(yè)參數(shù)為：噴霧量10 L/h，霧滴直徑小于50 μm，噴霧器檔位3檔，噴霧作業(yè)距離2 m，每處理區(qū)噴霧20 s/往復4次。每次噴霧施藥均在下午5～6點進行。每次均實地記錄了試驗期間天氣情況和試驗地的溫度和濕度。

在6次田間試驗噴霧后，第2 d和第3 d每天分早（8：00）、中（11：00）、晚（17：00）3次用背負式超低量噴霧器對濕度調(diào)控試驗區(qū)的海桐進行噴水霧補濕，補濕標準為海桐全株葉片充分潤濕而無明顯滴水。

1.7 田間噴霧量監(jiān)測與防效調(diào)查

1.7.1 噴霧量監(jiān)測 每次施藥前在每棵抽樣海桐的梢部周圍隨機抽取3片葉片，在每片葉片背面固定一張水敏紙。噴藥后立即帶水敏紙裝入小塑料袋，帶回實驗室計算霧滴密度，并采用霧滴分析軟件（重慶六六山下植保科技有限公司）估算單位面積葉片上的孢子懸浮液的沉積量。

1.7.2 防效調(diào)查 在田間噴霧施藥后，每隔1 d調(diào)查1次、記錄樣本枝條上的棉蚜蟲口數(shù)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

蟲口減退率（%）＝（處理前蟲口數(shù)－處理后蟲口數(shù)）/處理前蟲口數(shù)×100；校正防治效果（%）＝（處理后蟲口減退率－對照組蟲口減退率）/（1－對照組蟲口減退率）×100。

采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行Duncans氏新復極差顯著性分析（P＜0.05）和Probit回歸分析得出LC50和LT50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間防治試驗期間的氣象因子監(jiān)測

試驗地氣象因子的數(shù)據(jù)監(jiān)測在田間噴霧施藥后均持續(xù)8 d，6次田間試驗監(jiān)測到的環(huán)境溫濕度變化情況如圖1。同時記錄到整個田間試驗過程中，有5次降雨，分別是2018年9月13日，雷陣雨；2018年9月16日，雷陣雨；2018年9月17日，雷陣雨；2018年10月25日，小雨；2019年10月8日，小雨。

圖1 田間試驗時的環(huán)境平均溫度和平均相對濕度Fig.1 Average temperature and relative humidity in the period of field trials

從圖中曲線數(shù)據(jù)和變化來看，球孢白僵菌防治棉蚜的3次田間試驗的環(huán)境平均氣溫，最高26 ℃，最低12.5 ℃；平均相對濕度一般在60%～80%，偶有低于60%和高于80%的。玫煙色蟲草防治棉蚜3次田間試驗的環(huán)境平均氣溫，最高24 ℃，最低7.5 ℃；平均相對濕度在70%～90%范圍波動?？傮w來說，玫煙色蟲草和球孢白僵菌在棉蚜田間防治試驗中環(huán)境的平均溫度差異性較小，但在玫煙色蟲草防治棉蚜的田間平均相對濕度整體稍高。

2.2 田間防治試驗的噴霧量監(jiān)測

將帶回的水敏紙先掃描成圖片，再利用霧滴分析軟件進行霧滴分析，玫煙色蟲草第1次田間施藥落到葉面的平均沉積量為15.2 μL/cm2，第2次施藥為14.8 μL/cm2，第3次施藥為14.0 μL/cm2。球孢白僵菌第1次田間施藥的霧滴平均沉積量為14.5 μL/cm2，第2次施藥為15.0 μL/cm2，第3次施藥為14.0 μL/cm2。3次田間施藥的超低量噴霧操作一致性良好。

2.3 自然條件下兩種昆蟲病原真菌對棉蚜的防治效果

田間自然條件下，玫煙色蟲草Ifu13a對棉蚜的防治，從第4 d開始，1×108和1×107孢子/mL處理組的棉蚜蟲口減退率顯著高于空白對照組；第8 d時，1×108、1×107、1×106孢子/mL處理組的蟲口減退率為分別為67.31%、52.72%和24.12%，均與空白對照組差異顯著。玫煙色蟲草Ifu13a在田間自然防治棉蚜過程中，表現(xiàn)出了明顯的劑量效應(yīng)，即防治時噴施的孢子濃度越高，棉蚜種群的蟲口減退率就越高，防治效果差異出現(xiàn)的時間就越早（圖2A、B）。第8 d時，1×108、1×107和1×106孢子/mL處理組的校正防治效果分別為63%、46%和27%。

圖2 自然條件下玫煙色蟲草Ifu13a對棉蚜種群的田間控制作用Fig.2 Field control of A.gossypii population by C.fumisorosea Ifu13a under natural conditions

在田間自然條件下，球孢白僵菌Bb202對棉蚜的防治，從第4 d開始，所有球孢白僵菌試驗區(qū)的棉蚜蟲口減退率均與空白對照差異顯著，1×108、1×107和1×106孢子/mL試驗區(qū)的蟲口減退率分別為31.04%、29.12%和10.55%，而空白對照區(qū)的種群數(shù)量開始上升，蟲口增長率為2.55%（圖3A）。各防治試驗區(qū)的棉蚜校正防治效果在第6 d時即達到峰值，1×108、1×107和1×106孢子/mL試驗區(qū)的校正防治效果分別為43.75%、39.64%和19.95%（圖3B）。球孢白僵菌對棉蚜的劑量效應(yīng)在1×108和1×107孢子/mL兩個試驗區(qū)間差異不明顯，有劑量飽和現(xiàn)象。

圖3 自然條件下球孢白僵菌Bb202對棉蚜種群的田間控制作用Fig.3 Field control of A.gossypii population by B.bassiana Bb202 under natural conditions

2.4 環(huán)境濕度調(diào)控下兩種昆蟲病原真菌對棉蚜的防治效果

對環(huán)境進行濕度調(diào)控，即在田間防治后的第2 d和第3 d噴水霧增濕，可以明顯提高兩種昆蟲病原真菌對棉蚜種群的控制作用（圖4、圖5）。

環(huán)境增濕后，玫煙色蟲草Ifu13a自第3 d起，1×108、1×107孢子/mL防治區(qū)的蟲口減退率與空白對照區(qū)差異顯著；第6 d時，1.0×106孢子/mL防治區(qū)的棉蚜蟲口減退率急劇上升，開始與空白對照區(qū)的蟲口減退率差異顯著；第8 d比第7 d的蟲口減退率稍有增長，此時1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL各防治區(qū)的棉蚜校正防治效果分別為85.45%、84.63%和50.00%，與自然環(huán)境相比，分別提升22.54%、38.27%和22.77%（圖4）。

圖4 濕度調(diào)控下玫煙色蟲草Ifu13a對棉蚜種群的田間控制作用Fig.4 Field control of A.gossypii population by C.fumisorosea Ifu13a under humidity regulation

環(huán)境濕度調(diào)控均可明顯降低玫煙色蟲草各濃度防治區(qū)的半致死時間LT50（本文含義為：田間棉蚜種群減退率達到50%時所需要的時間），3個應(yīng)用濃度從高到低對應(yīng)的LT50分別下降了1.26、2.74和2.88 d；同時，半致死劑量LC50（田間棉蚜種群減退率達到50%時所需的真菌應(yīng)用濃度）也明顯降低，從4.86×107孢子/mL下降到9.93×106孢子/mL。結(jié)果表明，環(huán)境濕度調(diào)控明顯加快了玫煙色蟲草的殺蟲速度，提高了玫煙色蟲草田間防治的劑量效能（表2）。

表2 濕度調(diào)控對玫煙色蟲草防治棉蚜效果、半致死時間LT50和半致死濃度LC50的影響Table 2 Impact of humidity regulation on control effect, median lethal times (LT50), and median lethal concentration dosage (LC50) in the field control of A.gossypii by C.fumosorosea Ifu13a

田間的環(huán)境濕度調(diào)控對球孢白僵菌Bb202菌株防治棉蚜效果的影響同樣顯著（圖5），雖然同樣是從第4 d開始，各濃度防治區(qū)的蟲口減退率與對照區(qū)差異顯著，但1×108、1×107、1×106孢子/mL防治區(qū)的蟲口減退率下降更為明顯，分別為64.39%、45.78%和16.19%，比自然環(huán)境中相同濃度分別高出33.35%、16.66%、5.64%；第8 d時，各防治區(qū)的棉蚜校正防治效果分別為75.96%、64.24和12.60%，各防治區(qū)間差異顯著。環(huán)境濕度調(diào)控對田間防治效果的影響，顯示出一定的劑量效應(yīng)，田間應(yīng)用劑量較高，則環(huán)境濕度調(diào)控的防治效果越好；環(huán)境濕度調(diào)控下，1×108和 1×107孢子/mL防治區(qū)的校正防治效果分別提升了32.49%、22.60%，而1×106孢子/mL防治區(qū)與自然防治區(qū)相比差異不顯著。

圖5 濕度調(diào)控下球孢白僵菌Bb202對棉蚜種群的田間控制作用Fig.5 Field control of A.gossypii population by B.bassiana Bb202 under humidity regulation

從3個不同應(yīng)用濃度的半致死時間LT50來看，環(huán)境濕度調(diào)控可以加快白僵菌對棉蚜的控制速度；1.0×108、1.0×107和1.0×106孢子/mL三個防治區(qū)，球孢白僵菌Bb202對棉蚜的LT50比自然條件下分別低了2.95、2.27、1.32d（表3），環(huán)境濕度調(diào)控作用對較高真菌應(yīng)用濃度更明顯。在進行環(huán)境濕度調(diào)控后，球孢白僵菌Bb202菌株對棉蚜的LC50從自然條件下的1.17×108降低至3.50×107孢子/mL，表明增加環(huán)境濕度可以明顯增加菌株對目標害蟲的毒力水平。

表3 濕度調(diào)控對球孢白僵菌防治棉蚜效果、半致死時間LT50和半致死濃度LC50的影響Table 3 Impact of humidity regulation on control effect, median lethal times (LT50), and median lethal concentration dosage (LC50) in the field control of A.gossypii by B.bassiana Bb202

3 討論

昆蟲病原真菌常被噴灑真菌孢子來防治重要農(nóng)林害蟲，由于每次噴灑時的劑量、次數(shù)、環(huán)境因子等條件不同，常導致防治效果的差異。利用昆蟲病原真菌防治害蟲的本質(zhì)是有效地在害蟲種群中誘發(fā)真菌流行病，而昆蟲病原真菌、寄主害蟲與環(huán)境因子是流行病發(fā)生的三要素。由于在應(yīng)用昆蟲病原真菌防治目標害蟲時，病原真菌可以通過生物測定篩選得到高毒力菌株，防治時寄主昆蟲的蟲齡與蟲口密度也較容易人為確定，因此最影響田間實際防治效果的因素是環(huán)境因子，包括溫濕度、光照、風等，而溫度與濕度常被認為是最重要的兩個環(huán)境因子[21]。

不同昆蟲病原真菌由于生物學特性不同，有著不同最適溫區(qū)，如球孢白僵菌的最適溫度范圍是22 ℃～28 ℃，而棒束孢是18 ℃～22 ℃，棒束孢是偏低溫型流行菌株[22]。在本試驗中，兩種真菌對棉蚜都有較好的防治效果，但玫煙色蟲草Ifu13a菌株在自然和人工濕度調(diào)節(jié)環(huán)境中，對棉蚜的防治效果都要優(yōu)于球孢白僵菌Bb202菌株，這種差異除了與菌株的毒力水平有關(guān)外，可能還與玫煙色蟲草屬偏低溫型流行菌株有關(guān)。

對于很多昆蟲病原真菌的侵染而言，環(huán)境相對濕度可能比溫度相更為重要，相對濕度甚至是很多昆蟲病原真菌田間防治害蟲成功與否的最關(guān)鍵因素。白云等[23]發(fā)現(xiàn)環(huán)境濕度直接影響到白僵菌的流行病發(fā)生過程。田晶等[24]、Ramoska[25]、Narit等[26]在研究玫煙色蟲草、球孢白僵菌、綠僵菌的萌發(fā)與侵染中，均發(fā)現(xiàn)當相對濕度低于75%時，孢子萌發(fā)率和目標害蟲的死亡率低，而相對濕度越高，越有利于孢子萌發(fā)與侵染；昆蟲病原真菌對較高的環(huán)境濕度需求具有一定的共性。戴君惕[27]甚至認為只有相對濕度高于90%以上時，球孢白僵菌的孢子才能萌發(fā)并侵入蟲體，環(huán)境相對濕度接近 100%時，繁殖菌絲才能突出蟲體形成分生孢子。也有玫煙色蟲草在75%相對濕度中，對刺吸式口器害蟲防治效果良好的報道，這可能與菌株生物學特性及植物葉面的微生境有關(guān)[9]。在玫煙色蟲草防治棉蚜的田間試驗中，曹娜[28]發(fā)現(xiàn)降雨往往有利于提高蚜蟲的田間防治效果，因為降雨可以階段性地提高環(huán)境相對濕度；而Wang等[29]在利用球孢白僵菌防治松毛蟲的田間試驗中發(fā)現(xiàn)在環(huán)境相對濕度較高的春季更容易獲得良好的防治效果。本研究通過兩種昆蟲病原真菌防治棉蚜的田間試驗過程中階段性的田間補濕，顯著提升了球孢白僵菌和玫煙色蟲草對棉蚜的田間防治效率，進一步證實了環(huán)境相對濕度對昆蟲病原真菌侵染的重要意義，也證明了環(huán)境濕度調(diào)控是提升昆蟲病原真菌田間防治效果的有效途徑。這種環(huán)境濕度調(diào)控有利于克服濕度過低導致的孢子萌發(fā)與侵染障礙，對于提高昆蟲病原真菌的害蟲田間防治效果具有普遍意義，一般情況下均可應(yīng)用，但如果田間植物本身某種真菌性病害發(fā)生嚴重，那這種環(huán)境濕度調(diào)控對可能會加劇植物病害的影響則需要進行認真評估。

從試驗數(shù)據(jù)來看，環(huán)境濕度調(diào)控對多數(shù)田間應(yīng)用劑量均有顯著的防效提升作用，棉蚜死亡速度與死亡率均大幅提升，但如果應(yīng)用濃度過低則也可能防效提升不顯著。同時，在球孢白僵菌和玫煙色蟲草對棉蚜的田間試驗中，均發(fā)現(xiàn)了“劑量飽和”現(xiàn)象，即兩種真菌的 1×108和1×107孢子/mL防治區(qū)最終的校正防治差異不顯著。因此，在防治害蟲時，需要恰當選擇昆蟲病原真菌的田間應(yīng)用劑量。

昆蟲的真菌流行病的發(fā)生與否很大程度上決定于昆蟲病原真菌、寄主昆蟲與環(huán)境因子三者的流行病學關(guān)系，只有各環(huán)節(jié)有利于昆蟲真菌的侵染與傳播時，才可能有效地誘發(fā)害蟲種群的真菌流行病。本研究表明可以通過環(huán)境濕度調(diào)控來提高昆蟲病原真菌在田間對目標害蟲的防治效果。這種環(huán)境濕度調(diào)控技術(shù)尤其適用于相對濕度較低的季節(jié)及相對干旱的地區(qū)，而田間的環(huán)境濕度調(diào)控可以通過設(shè)施農(nóng)業(yè)裝備或直接通過無人機噴霧等技術(shù)手段得以實施。這種環(huán)境濕度調(diào)控的昆蟲病原真菌田間應(yīng)用策略，對昆蟲病原真菌的高效利用有著重要的參考意義。