王艷玲 譚芳 游意瑩 余小芳 黃菲
膿毒性急性腎損傷(SAKI)是一種重癥患者術(shù)后常見且嚴(yán)重影響預(yù)后的并發(fā)癥,發(fā)生率高達(dá)50%,是導(dǎo)致患者發(fā)展為慢性腎病甚至死亡的關(guān)鍵原因。前期研究已報(bào)道SAKI 主要發(fā)生在腎小管上皮細(xì)胞,且細(xì)胞焦亡是SAKI 發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件,通過抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡可明顯減輕SAKI,然而其機(jī)制尚未完全闡明。
研究表明,細(xì)菌等傷害性信號(hào)刺激使caspase-1活化,活化的caspase-1 一方面切割Gasdermin D誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔和破裂引起細(xì)胞死亡。另一方面促進(jìn)IL-1β 和IL-18 活化和釋放,引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞焦亡,而過度的細(xì)胞焦亡會(huì)因細(xì)胞死亡和級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致器官損傷和疾病的發(fā)生。原鈣黏附蛋白7(PCDH7)是鈣黏蛋白超家族的一組跨膜糖蛋白,廣泛參與細(xì)胞識(shí)別、通信、運(yùn)動(dòng)等細(xì)胞活動(dòng),介導(dǎo)生長(zhǎng)分化、炎癥、免疫應(yīng)答及腫瘤轉(zhuǎn)移等復(fù)雜生物學(xué)過程。有研究顯示PCDH 可通過干預(yù)炎癥因子、趨化因子等的募集和浸潤(rùn),控制級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng),參與疾病的防治。本研究擬評(píng)價(jià)脂多糖(LPS)刺激引起腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 表達(dá)和細(xì)胞焦亡過程的變化。
腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司,SYBR Green RT-PCR 試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO,BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司, PCDH7、NLR 家族Pyrin 域蛋白3(NLRP3)、caspase-1 和IL-1β 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司,MTT 試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、TNF-α 和IL-1β 含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自廣州杰特偉生物科技有限公司,原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Roche 公司。
1. 細(xì)胞培養(yǎng)
配制含10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基,將HK-2 復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中,加入7 mL培養(yǎng)基,并置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%融合時(shí),用0.05%胰蛋白酶消化并傳代,每4~5 d 傳代1 次,選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并且狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 實(shí)驗(yàn)分組與處理
HK-2 以1.5×10個(gè)/mL 的密度接種于96 孔培養(yǎng)板,研究分為Control 組和LPS 組。Control 組置于常氧恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%CO-21%O-74%N)中培養(yǎng)24 h;LPS 組加入含2 μg/mL LPS(Sigma公司, 美國(guó))的培養(yǎng)基,置于常氧恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h;每組設(shè)置復(fù)孔5 個(gè)。
3. 檢測(cè)方法
MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞焦亡率,ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞分泌TNF-α 和IL-6 的水平,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH 含量,分別參照產(chǎn)品說明書完成檢測(cè)。
4. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)
根據(jù)總蛋白提取裂解液說明書按步驟操作,取適量蛋白樣本進(jìn)行電泳,分離后轉(zhuǎn)膜、封閉。洗膜后加入一抗4℃孵育過夜,再加入二抗(1∶5000) 室溫下孵育1 h。洗膜3 次后顯色曝光。采用Tanon-4500 凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。
5. RT-PCR 法檢測(cè)mRNA 表達(dá)
按照RNA 快速提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞中的RNA,測(cè)定RNA 純度與濃度,逆轉(zhuǎn)錄后測(cè)定目的基因,選擇β-actin 作為內(nèi)參基因。
采用SPSS 22.0 軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖,使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性,Levene 檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)方差齊性。正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示,2 組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與Control 組比較,LPS 組明顯降低腎小管上皮細(xì)胞的生存率(P < 0.001),增加腎小管上皮細(xì)胞的焦亡率(P < 0.05),見表1。
表1 LPS 組與Control 組腎小管上皮細(xì)胞生存率、焦亡率比較(±s,n = 5) 單位:%
與Control 組比較,LPS 組炎癥因子TNF-α和IL-6 水平明顯升高(t= -24.381,P < 0.001;t= -15.205,P < 0.001),細(xì)胞損傷指標(biāo)LDH 水平也明顯升高(t= -8.771,P < 0.001),見圖1。
圖1 2 組細(xì)胞炎癥因子和LDH 水平變化
與Control 組比較,LPS 組PCDH7 表達(dá)明顯下調(diào),見圖2。
圖2 2 組腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 蛋白表達(dá)的比較
蛋白免疫印跡法灰度分析結(jié)果顯示,LPS 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1 及IL-1β表達(dá)均高于Control 組(t= -7.359,P = 0.009;t= -22.390,P = 0.001;t= -8.717,P =0.006),見圖3。
圖3 2 組細(xì)胞細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá)的比較
與Control 組比較,LPS 組PCDH7 mRNA 的表達(dá)下調(diào),NLRP3、caspase-1 和IL-1β mRNA 的表達(dá)上調(diào),見表2。
表2 2 組腎小管上皮細(xì)胞PCDH7、NLRP3、caspase-1、及IL-1β mRNA 表達(dá)的比較(±s,n = 5)
重癥患者常由于感染或腸黏膜屏障破壞、腸道菌群改變和微生物易位,引起全身性炎癥反應(yīng),改變宿主的免疫和代謝穩(wěn)態(tài),引起膿毒血癥,并驅(qū)動(dòng)術(shù)后急性腎損傷(AKI)的發(fā)生,而AKI 期間炎癥介質(zhì)和代謝產(chǎn)物的清除減少,進(jìn)一步導(dǎo)致腸道損傷和黏膜屏障破壞,加重SAKI,導(dǎo)致惡性循環(huán)從而造成嚴(yán)重后果。膿毒血癥患者圍術(shù)期病理生理變化非常復(fù)雜,術(shù)后AKI 的高發(fā)生率是影響患者預(yù)后和導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。
SAKI 同心源性、缺血再灌注等原因引起AKI明顯不同的病理學(xué)表現(xiàn),主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),而在其他原因AKI中常見的細(xì)胞壞死幾乎不存在。有證據(jù)表明,SAKI 的起源是多方面的,存在幾種并發(fā)機(jī)制,其中特有的募集和誘導(dǎo)炎癥因子、趨化因子、其他黏附分子等的浸潤(rùn),級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)在誘導(dǎo)最早期的細(xì)胞損傷尤為重要。組織修復(fù)與細(xì)胞死亡相關(guān)基因PCDH7 具有促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)優(yōu)于維持細(xì)胞黏附穩(wěn)定性的特點(diǎn),介導(dǎo)動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程。多項(xiàng)研究顯示PCDH 可通過調(diào)控炎癥因子和趨化因子等的募集和浸潤(rùn),參與多種疾病的防治。本研究基于上述研究背景,發(fā)現(xiàn)LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞引起細(xì)胞焦亡,伴隨PCDH7 的表達(dá)抑制,提示PCDH7 的表達(dá)減少可能參與LPS 引起的腎小管上皮細(xì)胞焦亡過程。
本研究使用LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞建立腎小管上皮細(xì)胞損傷模型,基于前期研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取濃度為2μg/mL 的LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞,結(jié)果表明LPS 引起以細(xì)胞焦亡損傷形式為主的腎小管上皮細(xì)胞損傷過程,表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞生存率下降,細(xì)胞焦亡率升高,炎癥因子IL-6 和TNF-α、細(xì)胞損傷指標(biāo)LDH 水平明顯升高,細(xì)胞焦亡指標(biāo)NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA 水平升高,此研究結(jié)果與同行相關(guān)研究結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上,為了確定 PCDH7是否參與LPS 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞焦亡過程,本研究進(jìn)一步觀察組織修復(fù)和細(xì)胞死亡相關(guān)基因PCDH7 的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞損傷過程伴隨PCDH7 蛋白和mRNA 的表達(dá)明顯下調(diào),提示PCDH7 的表達(dá)減少參與LPS 引起腎小管上皮細(xì)胞焦亡過程。研究報(bào)道了內(nèi)皮細(xì)胞中的“組織修復(fù)相關(guān)基因”PCDH 可通過細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)調(diào)控,在多種損傷修復(fù)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞極性遷移的作用。研究已證實(shí)PCDH1是氣道功能的重要物理屏障,吸煙明顯降低肺組織PCDH1 的表達(dá),誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞增多和氣道高反應(yīng)性。PCDH17 前體在潰瘍性結(jié)腸炎的受損黏膜中高表達(dá),參與創(chuàng)傷早期朝向創(chuàng)傷位點(diǎn)的細(xì)胞極化遷移。因此,我們認(rèn)為 LPS 可能通過調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞PCDH7 的表達(dá),介導(dǎo)細(xì)胞焦亡損傷過程。
DNA 甲基化是一種介導(dǎo)多種疾病發(fā)生過程的表觀遺傳修飾。研究揭示了PCDHB 基因甲基化在膿毒性炎癥反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)白細(xì)胞的黏附和遷移功能,影響膿毒癥的嚴(yán)重程度并導(dǎo)致不良預(yù)后。受損腎臟組織即使在起始的AKI 完全恢復(fù)以后,部分AKI 仍會(huì)向慢性腎臟病轉(zhuǎn)變,這種被稱為“損傷記憶”的現(xiàn)象就是由表觀遺傳學(xué)的改變介導(dǎo),肯定了以表觀遺傳學(xué)手段為靶向防治腎損傷的可行性。未來我們將進(jìn)一步從PCDH7 甲基化的角度深入探究其參與LPS 引起腎小管上皮細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制,進(jìn)而從表觀遺傳學(xué)角度為重癥患者術(shù)后SAKI 的精準(zhǔn)防治提供新思路。
綜上所述,LPS 刺激腎小管上皮細(xì)胞損傷的細(xì)胞焦亡過程與其對(duì)PCDH7 表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。