2022年3月16日，中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所分子探針與熒光成像研究組研究院徐兆超團(tuán)隊(duì)發(fā)展出在酸性條件下可自閃爍的單分子定位超分辨成像熒光探針LysoSR-549，實(shí)現(xiàn)了在12 nm/20 ms時(shí)空分辨率下長(zhǎng)達(dá)40 min的全細(xì)胞溶酶體解析。

長(zhǎng)時(shí)間超分辨熒光成像對(duì)于揭示納米尺度的細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)和功能越來(lái)越重要，但由于缺乏高度光穩(wěn)定和環(huán)境敏感的熒光探針為研究工具，一直以來(lái)，科研人員對(duì)細(xì)胞器互作網(wǎng)絡(luò)的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，尤其是細(xì)胞器納米級(jí)全景分布和時(shí)空過(guò)程所知尚少。

溶酶體是多功能細(xì)胞器，在降解生物分子、介導(dǎo)細(xì)胞代謝和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。溶酶體功能障礙在溶酶體貯積癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥中的作用也已得到證實(shí)，使溶酶體成為疾病治療靶點(diǎn)之一。溶酶體多重功能是通過(guò)溶酶體與其他細(xì)胞器的融合或接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，并由溶酶體動(dòng)力學(xué)介導(dǎo)，包括溶酶體的運(yùn)動(dòng)、溶酶體數(shù)量、大小、形態(tài)和腔內(nèi)酸性變化等。越來(lái)越多的證據(jù)表明，每個(gè)具有不同位置、運(yùn)動(dòng)軌跡和化學(xué)成分的溶酶體均具有特定的功能;而溶酶體同時(shí)受到系統(tǒng)水平上的調(diào)節(jié)，以溶酶體簇等集體行為在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能。破譯全細(xì)胞溶酶體的空間分布、化學(xué)成分和動(dòng)力學(xué)，可以了解和發(fā)現(xiàn)溶酶體的多功能和作用網(wǎng)絡(luò)，解析溶酶體個(gè)體功能與系統(tǒng)調(diào)控之間的關(guān)系。然而，溶酶體腔內(nèi)是pH值為4.5至5的酸性環(huán)境，使熒光探針無(wú)法在此條件下實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的時(shí)空超分辨和對(duì)溶酶體酸性的動(dòng)態(tài)識(shí)別。

科研團(tuán)隊(duì)將鄰甲基吡啶引入到羅丹明螺酰胺中，開(kāi)發(fā)了自閃爍探針LysoSR-549。研究發(fā)現(xiàn)，吡啶與異吲哚啉酮處于平面結(jié)構(gòu)，且吡啶N與羰基處于反式構(gòu)型。由于吡啶的堿性大于羰基，因而在弱酸性下，質(zhì)子優(yōu)先與吡啶N結(jié)合而遠(yuǎn)離羰基;隨著酸度的增加，吡啶環(huán)旋轉(zhuǎn)，質(zhì)子同時(shí)與羰基結(jié)合，使pH值在4.5至5范圍內(nèi)的少量染料發(fā)生開(kāi)環(huán)反應(yīng)，形成熒光兩性離子;后又與呫噸環(huán)10號(hào)位-C發(fā)生親核加成反應(yīng)，迅速恢復(fù)為不發(fā)熒光的螺內(nèi)酰胺，從而完成一次閃爍過(guò)程。

基于上述反應(yīng)機(jī)理，LysoSR-549自閃爍參數(shù)pKcycl被降低到3.2，使其能夠在溶酶體pH下進(jìn)行單分子定位超分辨成像（SMLM），并達(dá)到12 nm/20 ms時(shí)空分辨率，這是目前所報(bào)道的溶酶體超分辨成像中最高的定位精度。同時(shí)，溶酶體內(nèi)負(fù)載了大量的探針，由于只有少數(shù)探針處于閃爍發(fā)光狀態(tài)，這賦予了探針緩沖能力來(lái)抵抗光漂白，使LysoSR-549呈現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了40 min的長(zhǎng)時(shí)間超分辨率成像，從而在單個(gè)溶酶體分辨的水平上解析了全細(xì)胞內(nèi)所有溶酶體的運(yùn)動(dòng)軌跡，包括觀察到最長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)距離可達(dá)50 μm，最快運(yùn)動(dòng)速度可達(dá)0.31 μm/s。該探針的單分子光子數(shù)與pH值呈線性關(guān)系，從而可以在單分子成像過(guò)程中識(shí)別每個(gè)溶酶體pH值，最終實(shí)現(xiàn)了單個(gè)溶酶體解析水平上，同時(shí)分辨整個(gè)細(xì)胞中所有溶酶體的動(dòng)態(tài)和腔內(nèi)pH，并根據(jù)溶酶體分布、大小和腔內(nèi)pH值來(lái)分辨出全細(xì)胞溶酶體亞群。

LysoSR-549所具備的解析全細(xì)胞溶酶體的能力，使立體可視化追蹤和分辨溶酶體成為可能，從而可以發(fā)現(xiàn)很多之前未知的溶酶體化學(xué)和生物學(xué)信息、破解溶酶體的生物化學(xué)。該研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)整個(gè)細(xì)胞的所有溶酶體跨時(shí)間尺度追蹤，也可以聚焦在某一局部，或某一個(gè)溶酶體來(lái)做研究。

此外，該團(tuán)隊(duì)還對(duì)不同外界刺激下的全細(xì)胞溶酶體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同條件下溶酶體的大小、數(shù)量、分布、動(dòng)力學(xué)和腔內(nèi)pH值均有顯著差異，這或?yàn)槿苊阁w相關(guān)疾病診斷提供新方法。

相關(guān)研究成果以An Acid-regulated Self-blinking Fluorescent Probe for Resolving Whole-cell Lysosomes with Long-term Nanoscopy為題，發(fā)表在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》上。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、大連化物所創(chuàng)新基金等的支持。

（來(lái)源：中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所）