汪育泰，許智帆，劉婕，鐘國華

茚蟲威降解菌海藻酸鈉微球制劑研制及應(yīng)用效果

汪育泰，許智帆，劉婕，鐘國華*

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，廣州 510642

【目的】以海藻酸鈉為載體制備降解菌斯氏假單胞菌（）ACCC 02521菌株微球制劑，確定該制劑降解農(nóng)田土壤茚蟲威的應(yīng)用條件?！痉椒ā客ㄟ^微滴包埋成球法，將濕菌體重懸后加入海藻酸鈉溶液，混勻后逐滴滴至CaCl2溶液造粒，低溫固定后，以0.9% NaCl溶液洗滌，測定降解菌微球的傳質(zhì)性能和機械強度，確定海藻酸鈉最佳濃度。通過單因素優(yōu)化獲得最佳制劑配方，在3.0%海藻酸鈉溶液中分別滴入1.0%—5.0% CaCl2溶液、40—200 g·L-1菌量或20—100 g·L-1制劑，根據(jù)茚蟲威降解率，分別確定降解菌微球制劑CaCl2濃度、包埋菌量和用量。通過掃描電鏡觀察固菌前后微球形態(tài)、降解菌細胞形態(tài)和菌群分布情況。在不同類型土壤懸液、溫度、pH或不同時間條件下投入定量降解菌微球制劑，通過計算釋放菌量（CFU/mL）或茚蟲威降解率，評價環(huán)境因素對制劑釋放能力、降解效果和穩(wěn)定性的影響。噴霧施用后2 d撒施降解菌微球制劑，采集表層土壤檢測茚蟲威殘留量，確定田間施用劑量，明確制劑田間應(yīng)用條件。茚蟲威殘留濃度變化均以HPLC法檢測追蹤?！窘Y(jié)果】制劑由3.0%海藻酸鈉、2.0% CaCl2及80 g·L-1降解菌組成，粒徑約3.0 mm，降解菌微球粒徑大小均勻，機械強度適中，傳質(zhì)性能、降解活性和貯藏穩(wěn)定性良好。掃描電鏡觀測表明，降解菌在海藻酸鈉微球中分布均勻，菌體形態(tài)正常。在10—30℃、pH為6.0—8.0的土壤中，降解菌穩(wěn)定釋放，對茚蟲威降解率達到85%以上，釋放性能不受土壤類型影響，穩(wěn)定性良好，受環(huán)境條件影響小。田間噴施150 g·L-1茚蟲威乳油（EC）有效成分20 mg·L-1后2 d撒施降解菌微球制劑90—900 kg·hm-2時，茚蟲威殘留半衰期(T1/2)縮短至2.49—3.32 d（空白對照區(qū)T1/2為7.53 d）；有效成分5、20、50 mg·L-1噴施后2 d，均勻撒施降解菌微球制劑量450 kg·hm-2，土壤茚蟲威殘留T1/2由6.03—7.45 d縮短至2.34—3.59 d。【結(jié)論】以海藻酸鈉為載體制備降解菌斯氏假單胞菌微球制劑性能穩(wěn)定，可顯著降解農(nóng)田土壤茚蟲威殘留，縮短殘留半衰期，為土壤農(nóng)藥殘留污染生物修復(fù)提供了技術(shù)和產(chǎn)品支撐，具有進一步優(yōu)化和應(yīng)用的潛力。

茚蟲威殘留；生物修復(fù)；海藻酸鈉；斯氏假單胞菌；降解菌制劑

0 引言

【研究意義】茚蟲威（indoxacarb）屬噁二嗪類鈉通道阻斷劑型氨基甲酸酯類殺蟲劑，對多種作物害蟲高效[1-2]，與氰氟蟲腙、高效氯氰菊酯、溴蟲腈可能有交互抗性，與氰蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素等常用藥劑無明顯交互抗性[3]，在棉田、稻田和甘藍田土壤的半衰期為7—11 d[4-6]。茚蟲威對快速生長發(fā)育期的大鼠具有明顯的抑制作用，主要靶器官是脾臟和肝臟[7]，對蜜蜂、斑馬魚和家蠶屬中等毒性或高毒農(nóng)藥[8]；斑馬魚暴露于茚蟲威后會出現(xiàn)肝細胞凋亡現(xiàn)象，DNA損傷顯著，表現(xiàn)出遺傳毒性[9]。土壤農(nóng)藥殘留不僅直接影響非靶標生物安全，而且可能會增加作物吸收積累[10-11]，研發(fā)茚蟲威土壤殘留污染控制治理技術(shù)對于確保其安全高效使用、保障生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義。【前人研究進展】微生物降解是土壤農(nóng)藥殘留污染治理的高效安全方法[12-14]。實踐中，直接投放活性菌株的方式往往降解效果不佳[15-16]。合適的降解菌（或酶）制劑能夠改善降解菌在環(huán)境中的存活、定殖、增殖和擴散，提高降解效果。微生物固定化技術(shù)是制備降解菌制劑的關(guān)鍵技術(shù)，是利用物理或化學(xué)手段，將游離微生物定位于限定的空間區(qū)域，保持微生物對農(nóng)藥殘留物的代謝活性[17-18]。其中，活菌包埋法具有操作條件溫和、固定效果好、生物毒性低等特點，有利于保持較高的菌群濃度、存活率和代謝活性，常用于降解菌制劑制備[19-20]，如以改性蔗渣MSB-Mo作為載體材料，對降解菌HZ-2固定化處理，制備獲得的降解菌制劑3 d對硝磺草酮降解率達到99%[21]；采用海藻酸鈉（sodium alginate，SA）固定化處理菌株MB-1，對廢水中醚苯磺隆5 d降解率達到85%[22]?！颈狙芯壳腥朦c】海藻酸鈉是一種天然多糖，親水性強、黏著性小，水合能力強，能與二價陽離子發(fā)生交聯(lián)作用形成凝膠，是一種穩(wěn)定、環(huán)保、生物相容性好的活菌包埋載體[23-27]。本研究利用海藻酸鈉與CaCl2交聯(lián)形成的復(fù)合物為降解菌固定化載體，構(gòu)建高效、穩(wěn)定、降解活性高的斯氏假單胞菌（）制劑，降低農(nóng)田土壤茚蟲威殘留，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供選用產(chǎn)品?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確茚蟲威降解菌海藻酸鈉微球制劑（簡稱：降解菌微球制劑）的制備方法及應(yīng)用條件，維持并提高降解菌在實際環(huán)境的存活率、抗逆性及降解活性，為農(nóng)田茚蟲威殘留污染生物修復(fù)提供技術(shù)和產(chǎn)品基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 降解菌培養(yǎng)

經(jīng)篩選獲得茚蟲威降解菌斯氏假單胞菌，進一步研究時購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC），菌株編號為ACCC 02521（降解活性得到驗證）。將-80℃凍存菌室溫融解后，按0.1%（/）接種至Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，置于30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h。經(jīng)過4℃、6 500 r/min離心10 min收集菌體沉淀，0.9%生理鹽水沖洗離心3次得到濕菌體（約8.0×1010CFU/mL），置于4℃冰箱備用。

1.2 供試藥劑

茚蟲威標準品（純度97%）購自上海安譜實驗科技股份有限公司；150 g·L-1茚蟲威乳油（EC），美國富美實公司生產(chǎn)（PD20101870），色譜級乙腈和甲醇購自賽默飛科技公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 色譜檢測方法

取5 g土壤樣品或5 mL含藥LB培養(yǎng)基于50 mL離心管，加入5 mL乙腈，渦旋振蕩30 s，加入NaCl 3 g后振蕩30 s，超聲處理30 min，以6 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL經(jīng)0.22 μm微孔有機膜過濾后濾液收集于棕色進樣瓶，高效液相色譜法（HPLC）分析。檢測條件：Agilent 1260型高效液相色譜儀，C18色譜柱（Athena 250×4.6 mm，5 μm），紫外檢測器，乙腈﹕水=80﹕20（﹕）流動相，流速1 mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長310 nm，進樣量20 μL。在此方法下，茚蟲威峰型尖銳、對稱，保留時間6.29 min，標準曲線方程=50.592+39.838，相關(guān)系數(shù)2=0.997。培養(yǎng)液茚蟲威添加濃度1、20、50 mg·L-1，回收率94.3%—101.8%，RSD 2.8%—4.3%；土壤茚蟲威添加濃度0.1、1、20、50 mg·kg-1，添加回收率83.5%—102.3%，RSD 2.6%—5.6%。

1.4 降解菌微球制劑的制備及性質(zhì)檢測

將斯氏假單胞菌濕菌體重懸后加入100 mL海藻酸鈉溶液（已滅菌處理，下同），混勻后逐滴滴至CaCl2溶液造粒。置于4℃冰箱固定2 h后，用0.9% NaCl溶液洗滌微球3次，室溫下置于無菌濾紙充分濾干，移入離心管中密封保存、備用。用游標卡尺測量1 000粒降解菌微球粒徑，統(tǒng)計分析其粒徑分布情況。

將40 g·L-1菌懸液加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%海藻酸鈉溶液制備降解菌微球制劑，測定降解菌微球的傳質(zhì)性能[28]和機械強度[29]，確定海藻酸鈉最佳濃度（傳質(zhì)性能測定方法略有改進，利用圖片軟件ImageJ分析微球灰度值，值越大表示傳質(zhì)能力越強）。

按上述方法制備兩組降解菌微球制劑：（1）將菌懸液按40 g·L-1用量加入到3.0%海藻酸鈉溶液（濃度由上述試驗確定，下同），然后分別滴入濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% CaCl2溶液[30]；（2）將40、80、120、160、200 g·L-1菌懸液分別加入到3.0%海藻酸鈉溶液。將制備得到的兩組制劑按60 g·L-1用量加至50 mL搖瓶培養(yǎng)基（pH 7.0，含20 mg·L-1茚蟲威）中，于30℃、160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)7 d，以空白海藻酸鈉微球為對照（下同），根據(jù)茚蟲威降解率，確定降解菌微球制劑中CaCl2濃度和包埋菌量。

將40 g·L-1菌懸液加至3.0%海藻酸鈉溶液，按上述方法制備降解菌微球制劑后，分別以制劑量20、40、60、80、100 g·L-1加進50 mL搖瓶培養(yǎng)基（pH 7.0，含20 mg·L-1茚蟲威），于30℃、160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)7 d，測定茚蟲威降解率，確定制劑用量。

1.5 降解菌微球內(nèi)部形態(tài)觀察

取降解菌微球制備掃描電鏡樣品，以空白海藻酸鈉微球作為對照，觀察固菌前后微球形態(tài)、降解菌細胞形態(tài)和菌群分布情況。掃描電鏡樣品采用臨界點干燥法制備，取降解菌微球剖開，用1 mL生理鹽水沖洗兩次，加入2.5%戊二醛固定液1 mL，放入4℃冰箱過夜固定。用pH 7.0磷酸鹽緩沖液（PBS）處理10 min，共處理3次，用1%鋨酸熏蒸固定樣品60 min，分別用30%、50%酒精沖洗樣品10 min，70%酒精處理2 h，90%、100%酒精沖洗樣品10 min。經(jīng)高真空鍍金膜處理，進行掃描電鏡觀察。

1.6 環(huán)境因素對降解菌微球制劑釋放能力的影響

設(shè)計3組試驗：（1）分別在100 mL錐形瓶加入50 g滅菌黃壤土（采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場，呈土黃色，粉土含量高，富含礦物質(zhì)）和50 g滅菌紅壤土（采集于湖南省株洲市茶陵縣，呈紅色，富含鐵、鋁氧化物），各加入50 mL滅菌水，調(diào)節(jié)土懸液pH至7.0，加入5 g降解菌微球制劑，置于30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h，每隔8 h取樣一次，每次取1 mL土懸液在固體LB培養(yǎng)基稀釋涂布平板計數(shù)（分別稀釋105、106、107倍），計算降解菌微球的釋放菌量（CFU/mL），考察土壤類型的影響；（2）土壤類型為黃壤土，搖床培養(yǎng)溫度分別為10、20、30、40、50℃，其余同（1）組試驗，考察溫度的影響；（3）土壤類型為黃壤土，調(diào)節(jié)土懸液pH至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其余與（1）組試驗相同，考察pH的影響。

1.7 環(huán)境因素對降解菌微球制劑降解效果的影響

在50 mL滅菌搖瓶培養(yǎng)基（pH 7.0，含20 mg·L-1茚蟲威）中，加入3 g降解菌微球制劑，分別在10、20、30、40、50、60℃條件160 r/min恒溫搖床培養(yǎng)7 d，測定茚蟲威降解率，考察溫度對制劑降解效果的影響。將pH分別設(shè)置為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培養(yǎng)溫度固定為30℃，其余與溫度試驗條件相同，考察pH對降解菌制劑降解效果的影響。

1.8 降解菌微球制劑的穩(wěn)定性

設(shè)計3組試驗：（1）在pH 7.0的PBS加入降解菌微球制劑，分別于10、20、30、40、50、60℃放置24 h。分別取3 g處理后的微球制劑，加至50 mL搖瓶培養(yǎng)基中（pH 7.0，含20 mg·L-1茚蟲威），于160 r/min、30℃恒溫搖床培養(yǎng)7 d，測定茚蟲威降解率，評價溫度穩(wěn)定性；（2）將PBS的pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，處理溫度固定為30℃，其余同（1）組試驗，評價pH穩(wěn)定性；（3）在50 mL滅菌搖瓶培養(yǎng)基中（pH 7.0，含20 mg·L-1茚蟲威），分別加入3 g已30℃儲存1、2、3、4、5、6、7、8周的降解菌微球制劑，搖床培養(yǎng)條件同（1）試驗，評價儲存穩(wěn)定性。

1.9 降解菌微球制劑的田間降解作用

試驗地點為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場，選取未施用農(nóng)藥半年以上的試驗田，劃定小區(qū)，每小區(qū)面積10 m2，各小區(qū)間隔0.5 m，對照和處理相間排列，設(shè)計兩項田間試驗：（1）確定降解菌微球制劑田間用量。供試藥劑150 g·L-1茚蟲威EC按用水量750 L·hm-2兌水稀釋至有效成分20 mg·L-1均勻噴霧后2 d，設(shè)置6個處理：均勻撒施降解菌微球制劑量90、450、900 kg·hm-2，降解菌液組（原液1×109CFU/mL用量10 L·hm-2，用水量750 L·hm-2），海藻酸鈉微球組（不含降解菌，用量450 kg·hm-2），清水對照組（用水量750 L·hm-2）。施用后0、1、3、5、7、14、21、28 d，采集0—10 cm表層土壤，以HPLC法檢測茚蟲威殘留量計算半衰期（T1/2）；（2）確定微球制劑推薦劑量對茚蟲威不同殘留量的降解作用。供試150 g·L-1茚蟲威EC清水750 L·hm-2稀釋至有效成分5、20、50 mg·L-1田間噴施后2 d，均勻撒施降解菌微球制劑450 kg·hm-2，茚蟲威殘留檢測和半衰期計算方法同試驗（1）。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各項試驗于2019—2021年完成，各處理及對照均設(shè)3個重復(fù)。降解率（%）=（1-At/A0）×100，其中，At表示反應(yīng)時間t時降解菌制劑處理組茚蟲威濃度，A0為空白對照組茚蟲威濃度。降解動力學(xué)符合一級動力學(xué)模型：Ct=C0×e-k t，其中，Ct為在反應(yīng)時間t時的茚蟲威殘留濃度（mg·kg-1），C0為茚蟲威起始濃度，為降解速率常數(shù)（d-1），半衰期T1/2=ln2/（d）。數(shù)據(jù)和圖表采用SPSS25軟件處理，差異顯著性采用DMRT法（=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 降解菌微球制劑配方的確定

通過檢驗不同用量海藻酸鈉、CaCl2及包埋菌量對微球形態(tài)、結(jié)構(gòu)及降解活性的影響，明確降解菌微球制劑配方。當海藻酸鈉用量為3.0%時，微球形態(tài)完整，機械強度好，傳質(zhì)性能佳，其他用量出現(xiàn)不同程度造粒難、機械強度差、傳質(zhì)效率低等問題（表1）。

恒溫搖床培養(yǎng)7 d后，當CaCl2濃度為2.0%時，降解菌微球制劑對茚蟲威降解率最高，為96.73%，濃度超過2.0%后，可能因CaCl2與海藻酸鈉交聯(lián)形成的微球密度過大，阻礙降解菌釋放或生長，導(dǎo)致茚蟲威降解率下降（圖1-A）。包埋菌量為80 g·L-1時，降解菌微球制劑對茚蟲威降解率最高，為95.51%（圖1-B）。綜上確定茚蟲威降解菌微球制劑配方為3.0%海藻酸鈉、2.0% CaCl2及80 g·L-1降解菌。隨機測量1 000粒微球直徑，表明微球粒徑為（3.0±0.5）mm，其中95.1%微球粒徑介于2.8—3.2 mm（圖1-D），說明制備所得的降解菌微球粒徑均勻。

通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，降解菌群在海藻酸鈉微球里分布均勻，菌體形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，表明降解菌與海藻酸鈉形成穩(wěn)定的固定化復(fù)合物（圖2-A、2-B），可進一步檢測降解特性。

2.2 降解菌微球制劑的降解特性

由圖3-A可知，在10—40℃范圍內(nèi)降解菌微球制劑釋放的菌量差異不顯著，溫度升至50℃時釋放菌量顯著下降，說明在常溫范圍內(nèi)降解菌微球制劑保持穩(wěn)定的釋放能力；其次，在10—30℃范圍內(nèi)降解菌微球制劑對茚蟲威降解效果好，處理48 h后降解率95%以上，但50—60℃時，降解率顯著下降（圖3-B），說明50℃以上時影響降解菌劑的降解活性，菌量釋放與降解效率趨勢一致。

表1 海藻酸鈉用量對降解菌微球性能的影響

同列數(shù)據(jù)后小寫字母相同表示差異不顯著（DMRT法，=0.05）

The same lowercase letters after the data in the same column indicate no significant difference (DMRT method,=0.05)

CaCl2濃度（A）、包埋菌量（B）、制劑使用量（C）對微球制劑降解率的影響 Effects of CaCl2 concentration (A), amount of embedded bacteria (B), and preparation dosage (c) on microspheres degradation rate；D：降解菌微球制劑的粒徑分布圖（n=1000） Particle size distribution of microspheres of degrading bacteria (n=1000)。柱上小寫字母相同表示差異不顯著（DMRT法，P=0.05）The same lowercase letters on the bars indicate no significant difference (DMRT method, P=0.05)。下同The same as below

A：未添加降解菌Without degrading bacteria；B：固定降解菌Immobilization of degrading bacteria

A：微球釋放能力Release capacity of microspheres；B：制劑降解效果Degradation effect of bacteria preparation

不同pH顯著影響降解菌制劑釋放性能，pH為6.0—9.0時菌量釋放穩(wěn)定，在pH 5.0條件下釋放菌量明顯下降，說明中性偏堿環(huán)境有利于降解菌釋放（圖4-A）；pH為6.0—8.0時，茚蟲威降解率保持在85%以上，穩(wěn)定性較好，但pH為4.0、5.0、10.0時，降解率降至60%以下，說明過于酸性或堿性環(huán)境均不利于發(fā)揮降解效果（圖4-B），與菌量釋放的趨勢相似。

供試黃壤土和紅壤土水懸液中投放降解菌微球制劑8—48 h，隨時間延長，茚蟲威降解菌量均增加，但相同時間內(nèi)兩種土壤水懸液釋放菌量差異均不顯著（圖5），說明土壤類型對降解菌微球制劑的釋放能力影響不明顯。降解菌微球制劑在30℃保存3周內(nèi)對茚蟲威降解率90%以上，保存8周內(nèi)對茚蟲威降解率81%以上，隨著保存時間的延長降解率略有降低（圖6）。

2.3 降解菌微球制劑的田間應(yīng)用效果

田間噴施150 g·L-1茚蟲威EC有效成分20 mg·L-1后2 d，均勻撒施降解菌微球制劑90、450、900 kg·hm-2或噴施降解菌菌液處理后28 d，均能顯著降低土壤茚蟲威殘留水平（圖7），空白對照（CK）和僅撒施等量微球時半衰期T1/2分別為7.53 d和6.30 d，噴施降解菌菌液處理T1/2為4.20 d，降解菌微球制劑處理T1/2縮短至2.49—3.32 d（表2），說明制劑處理可顯著提高茚蟲威在土壤中的降解速率?；谥苿┏杀究剂浚到饩⑶蛑苿┨镩g應(yīng)用推薦用量為450 kg·hm-2。

圖4 pH對降解菌微球制劑釋放能力（A）和降解率（B）的影響

圖5 土壤類型對降解菌微球制劑釋放能力的影響

圖6 降解菌微球制劑的儲存穩(wěn)定性

表2 降解菌微球制劑對田間土壤茚蟲威半衰期的影響

：農(nóng)藥殘留量pesticide residue (mg·kg-1)；：降解時間degradation time (d)。表3同 The same as Table 3

圖7 降解菌微球制劑對田間土壤茚蟲威的降解效果

供試150 g·L-1茚蟲威EC以有效成分5、20、50 mg·L-1田間噴施后2 d，均勻撒施降解菌微球制劑量450 kg·hm-2，28 d后對土壤茚蟲威殘留降解率分別達到93.5%、92.7%、91.2%（圖8），其T1/2縮短至2.34—3.59 d（表3），分別比未撒施降解菌微球制劑同劑量處理的T1/2縮短52%—61%，說明所制備的降解菌微球制劑能顯著提高土壤中茚蟲威的降解速率，縮短半衰期，生物修復(fù)效果良好，具有應(yīng)用潛力。

圖8 降解菌微球制劑對土壤中不同初始含量茚蟲威的降解效果

表3 降解菌制劑450 kg·hm-2處理對土壤茚蟲威半衰期的影響

3 討論

3.1 海藻酸鈉包埋法適用于農(nóng)藥降解菌固定化

農(nóng)藥殘留微生物降解本質(zhì)上是降解菌與外源農(nóng)藥的酶促代謝反應(yīng)，由于該過程易受環(huán)境因素影響，因此如何使目標微生物固定、定殖、增殖并保持降解活性成為實踐應(yīng)用中需要突破的關(guān)鍵。目前微生物固定化方法主要有吸附法、交聯(lián)法、結(jié)合法和包埋法，不同的固定方法和載體材料制成的降解菌制劑差別很大，這是影響制劑中功能微生物釋放性能的重要原因[28]。如使用海藻酸鈉作為載體，以葡萄糖為輔助材料固定化降解菌，制備降解菌制劑，能顯著提高對甲基對硫磷和殺蟲畏兩種農(nóng)藥的降解率[29]；以玉米稈、麥稈、花生殼等作為載體分別固定化處理降解菌白腐真菌sp.、，5 d內(nèi)對土壤中克百威和毒死蜱降解率分別為69.83%、74.69%，穩(wěn)定性和降解效果增強[30]；利用生物炭固定化處理菌株湛江芽孢桿菌（）TJTB48、假堅強芽孢桿菌（）TJTB58和金氏海洋桿菌（）TJTB66，制備降解菌制劑，在40 d內(nèi)土壤中氯氰菊酯降解率82.18%，半衰期縮短了6.4 d，降解效果優(yōu)于單菌株對氯氰菊酯的降解[31]。采用包埋法制備農(nóng)藥降解菌制劑具有成本低廉、操作簡單等特點，有利于提高制劑中降解菌種群密度，增強代謝穩(wěn)定性和環(huán)境抗逆性，從而提高環(huán)境存活率和降解活性[32-34]。選用易于獲取、易于操作、對活性菌株無毒害作用的固定化載體是提高包埋效率的關(guān)鍵[35]。本研究采用環(huán)境友好、生物相容性高的天然多糖海藻酸鈉為降解菌載體的主要組分，通過與CaCl2交聯(lián)形成勻質(zhì)、多孔且具備一定機械抗壓能力的微球狀載體，通過微滴包埋法固定活菌細胞，制成茚蟲威降解菌海藻酸鈉微球制劑。結(jié)果表明，固定后降解菌均勻、廣泛附著于微球的孔隙內(nèi)，其存活率、降解活性不受影響，且菌株對外部環(huán)境的抗逆性顯著提高，說明海藻酸鈉包埋法適用于農(nóng)藥降解菌固定化。然而，高溫滅菌在一定程度可能破壞海藻酸鈉結(jié)構(gòu)，影響與CaCl2的交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致黏性降低，在后續(xù)研究中應(yīng)進一步優(yōu)化海藻酸鈉載體配置，提高耐熱性等結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，或采用其他滅菌方式以滿足無菌制備的需求。

3.2 農(nóng)藥降解菌制劑應(yīng)用中有待解決的重點問題

本文研制的降解菌微球制劑，降解菌在微球中附著良好，分布廣泛，明確了溫度、pH、土壤類型、菌劑使用量、貯存時間、土壤農(nóng)藥用量等因素對微球制劑降解茚蟲威殘留的影響，但成本還較高，降解對象特異性較高，離實踐應(yīng)用還有一定差距，需要進一步完善。由于降解菌制劑在土壤中的釋放性能不穩(wěn)定、土壤中降解菌的存活率不高、降解活性低、制備成本高、載體材料二次污染問題等原因，大部分微生物固定化的技術(shù)還難以推廣應(yīng)用到田間。農(nóng)藥降解菌要從理論走向?qū)嵺`，應(yīng)解決的關(guān)鍵問題包括：（1）高效廣譜的菌株，尤以降解譜較寬、環(huán)境適合度高、安全性能好的菌種至關(guān)重要；（2）合適的載體材料和固定方法，為了避免載體材料的二次污染問題，可以通過使用天然有機材料來解決，如瓊脂、海藻酸鈉、殼聚糖等，或者應(yīng)用甘蔗渣、蠶沙、植物纖維等生物質(zhì)材料，這些材料均生物相容性強、對環(huán)境友好[19,36-37]；（3）制劑田間應(yīng)用條件，包括菌劑劑型（如制成液態(tài)制劑還是固體制劑）、菌劑使用量、使用方法（如噴霧還是撒施）等，重視目標殘留農(nóng)藥污染程度、土壤類型、pH、溫度、濕度、作物環(huán)境對菌劑發(fā)揮效果的影響，要解決降解菌制劑生產(chǎn)和使用成本的“瓶頸”，提高效益，才能真正推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

以海藻酸鈉為載體制備降解菌（斯氏假單胞菌）微球制劑，當海藻酸鈉濃度為3.0%、CaCl2濃度為2.0%、包埋菌量為80 g·L-1時，所得降解菌微球粒徑大小均勻，機械強度適中、傳質(zhì)性能良好；降解菌在海藻酸鈉微球中分布均勻，菌體形態(tài)正常；制劑的釋放能力及穩(wěn)定性良好，受環(huán)境條件影響小，貯藏穩(wěn)定性較好；田間試驗表明，按制劑用量450 kg·hm-2處理，田間土壤茚蟲威半衰期顯著縮短至2.34—3.59 d，為土壤茚蟲威殘留污染生物修復(fù)提供了技術(shù)基礎(chǔ)和產(chǎn)品支撐，具有進一步優(yōu)化的潛力和應(yīng)用的前景。

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Preparation and Application of Indoxacarb degrading Bacteria immobilized Sodium Alginate Microspheres

WANG Yutai, XU Zhifan, LIU Jie, ZHONG Guohua*

College of Plant Protection, South China Agricultural University, Guangzhou 510642

【Objective】The objective of this study is to prepare microsphere of degrading bacterium(ACCC 02521) with sodium alginate as carrier, and to establish the application conditions for degrading indoxacarb in farmland.【Method】Through the micro drop embedding ball forming method, bacteria were suspended and added into sodium alginate solution.After mixing, it was dropped into CaCl2for granulation.It was washed with 0.9% NaCl after fixing at low temperature.The mass transfer performance and mechanical strength of degrading bacteria microspheres were measured to determine the optimal concentration of sodium alginate.The best formulation was obtained by single factor optimization.1.0%-5.0% CaCl2, 40-200 g·L-1bacteria or 20-100 g·L-1preparation were dropped into 3.0% sodium alginate, respectively.The CaCl2concentration, embedded bacteria and preparation dosage in the degrading bacteria microspheres were determined according to the degradation rate of indoxacarb.The morphology of microspheres, cell morphology and distribution of degrading bacteria were observed by scanning electron microscope.Quantitative degrading bacteria microspheres were put into different types of soil suspension, temperature, pH or treatment time.The effects of environmental factors on the release capacity, degradation effect and stability of degrading bacteria microspheres were evaluated by calculating the amount of released bacteria (CFU/mL) or the degradation rate of indoxacarb.Two days after the routine application of pesticides, the degrading bacteria microsphere preparation was applied.Topsoil was collected to detect the residue of indoxacarb, the field application of dose was determined, and the field application conditions of the preparation were determined.The residual concentrations of indoxacarb were detected and tracked by HPLC.【Result】The preparation was composed of 3.0% sodium alginate, 2.0% CaCl2and 80 g·L-1degrading bacteria.The particle size was about 3.0 mm.The degrading bacteria microspheres had uniform particle size, moderate mechanical strength, good mass transfer performance, degradation activity and storage stability.Scanning electron microscopy showed that the degrading bacteria were evenly distributed in sodium alginate microspheres and their morphology was normal.In the soil with 10-30℃ and pH of 6.0-8.0, the degrading bacteria were released stably, and the degradation rate of indoxacarb was more than 85%.The release performance was not affected by soil type, the stability was good, and was less affected by environmental conditions.When 90-900 kg·hm-2of degrading bacteria microspheres were applied 2 d after field spraying of 150 g·L-1of EC active ingredient 20 mg·L-1, the residual half-life (T1/2) of indoxacarb in soil was shortened to 2.49-3.32 d (7.53 d for blank control area); furthermore when 450 kg·hm-2of degrading bacteria microspheres were applied 2 d after spraying indoxacarb with 5, 20 and 50 mg·L-1, the values of T1/2was shortened from 6.03-7.45 d to 2.34-3.59 d.【Conclusion】The preparation of degrading bacteriamicrospheres with sodium alginate as carrier has stable performance, can significantly degrade indoxacarb residues in farmland and shorten T1/2time, provides technical and product support for bioremediation of soil pesticide residue pollution, and has the potential for further optimization and application.

indoxacarb residue; bioremediation; sodium alginate;; degrading bacteria preparation

2021-05-15；

2021-06-16

國家自然科學(xué)基金（31871988）、廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃（2018B20205003）

汪育泰，E-mail：578554241@qq.com。許智帆，E-mail：seekfunmeso@163.com。汪育泰和許智帆為同等貢獻作者。通信作者鐘國華，E-mail：guohuazhong@scau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）