謝冰　王萍　劉峰

摘要：目的：探討二甲雙胍治療2型糖尿病患者中誘發(fā)阿爾茲海默癥的相關(guān)研究。方法：選取實驗鼠，全部為年齡較大的，對于這些老鼠全部給予高脂高糖的食物和飲水，并且一直持續(xù)，通過相關(guān)糖尿病指標(biāo)檢測后，這些實驗鼠全部稱為身體素質(zhì)不健康的T2D損傷大鼠。T2D損傷大鼠模型繼續(xù)高脂高糖飲食，并分別使用二甲雙胍，以及二甲雙胍合并甲基化抑制劑進(jìn)行添加喂養(yǎng)。RNA-seq篩選可能相關(guān)作用通路，一直保持給予固定數(shù)量的熒光PCR和Western blot ，這樣可以在阿爾茲海默癥相關(guān)基因活動時進(jìn)行監(jiān)控，主要監(jiān)控其DNA轉(zhuǎn)錄到RNA，當(dāng)然還有DNA表達(dá)成蛋白質(zhì)這兩個過程，并對兩組小鼠進(jìn)行腦組織病理檢測，并對二代基因測序。推測二甲雙胍是否通過R-loops影響相關(guān)基因甲基化程度，進(jìn)而影響DNA的穩(wěn)定性，縱向影響糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥的進(jìn)展。結(jié)果：小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT-22如果進(jìn)行甲基化抑制劑聯(lián)合培養(yǎng)，就可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的R-loops水平明顯降低，因此使得基因甲基化水平的也明顯下降，確定R-loops在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)節(jié)基因甲基化水平。而實驗組的T2D損傷大鼠模型只是對其進(jìn)行二甲雙胍干預(yù)后，檢測發(fā)現(xiàn)實驗組的R-loops水平明顯降低，基因甲基化水平的也明顯下降。結(jié)論：二甲雙胍可以通過調(diào)節(jié)患者R-loops水平，影響DNA的穩(wěn)定性，改善糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥。

關(guān)鍵詞：二甲雙胍;2型糖尿病;誘發(fā)阿爾茲海默癥：

一、資料與方法

（一）一般資料

R-Loops是由RNA-DNA雜交和DNA移位鏈組成的三鏈結(jié)構(gòu)，研究表明，其與DNA的穩(wěn)定性有關(guān)，引起相關(guān)神經(jīng)退行性病變。二甲雙胍是公認(rèn)的治療糖尿病的一種藥物，而且醫(yī)生也是對于2型糖尿病一直給予二甲雙胍的治療，而二甲雙胍對于阿爾茲海默癥的作用卻出現(xiàn)截然不同的兩種研究推論。因此，本項目旨在討論R-Loops與糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥之間的關(guān)系，二甲雙胍在糖尿病并發(fā)阿爾茲海默中的作用，探索其可能的分子機(jī)制，究竟二甲雙胍是不是阿爾茲海默癥的罪魁禍?zhǔn)?，糖尿病并發(fā)這個病癥是為什么，以下內(nèi)容將對此進(jìn)行新的理論論述，并探索分子檢測手段等預(yù)警機(jī)制，為糖尿病治療提供用藥指導(dǎo)。

（二）方法

1）2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2D）損傷大鼠模型的建立：選取實驗鼠，全部為年齡較大的，對于這些老鼠全部給予高脂高糖的食物和飲水，并且一直持續(xù)，通過相關(guān)糖尿病指標(biāo)檢測后，這些實驗鼠全部稱為身體素質(zhì)不健康的T2D損傷大鼠。

2）二甲雙胍對2型糖尿病損傷大鼠并發(fā)阿爾茲海默癥中的作用：T2D損傷大鼠模型繼續(xù)高脂高糖飲食，并分別使用二甲雙胍，以及二甲雙胍合并甲基化抑制劑進(jìn)行添加喂養(yǎng)。采用正常飲食的老年大鼠為正常組，定期進(jìn)行糖尿病相關(guān)指標(biāo)檢測，血糖以及相關(guān)基因蛋白檢測，確認(rèn)藥物對于造模效果的影響;采用Morris水迷宮試驗，對各實驗組進(jìn)行記憶相關(guān)的腦區(qū)功能評價。

3）RNA-seq篩選可能相關(guān)作用通路：提取各糖尿病模型組和對照鼠組的腦組織總RNA，交于基因測序公司進(jìn)行RNA全轉(zhuǎn)錄組測序檢測。檢測結(jié)果通過標(biāo)準(zhǔn)化處理、差異篩選后，進(jìn)行GO分析、Pathway 分析，篩選出二甲雙胍影響DNA穩(wěn)定性-腦軸-神經(jīng)內(nèi)分泌功能相關(guān)性最大的作用通路。

4）運用qPCR和Western blot方法驗證 RNA-seq 篩選出的信號通路各糖尿病模型組和對照鼠組的腦組織總RNA和總蛋白一直保持給予固定數(shù)量的熒光PCR和Western blot ，探究RNA-seq ，對于其中的通路中重要蛋白進(jìn)行篩選，阿爾茲海默癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)行檢測。

a）??????? qPCR：使用Trizol提取組織或細(xì)胞的總RNA后，經(jīng)NanoDrop2000測定濃度;使用TaKaRa PrimerScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);根據(jù)Genebank序列設(shè)計目的基因的引物序列并合成;使用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒在Biosystems ViiATM 7 Real-Time PCR儀上熒光擴(kuò)增，分析基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。

b）??????? Western blot：裂解細(xì)胞或組織提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度;SDS-PAGE凝膠電泳：條件為恒壓100V，待染料前沿移行到距離凝膠底部2-3mm時方可停止（約120min）;轉(zhuǎn)膜：條件為恒流250mA ，2h;轉(zhuǎn)膜后TBS漂洗，加5%脫脂奶粉室溫封閉1小時;一抗封膜之后室溫條件下?lián)u1h然后放入4℃冰箱中過夜;PBST洗膜3次，10min/次;二抗室溫孵育1h，PBST洗膜3次后，ECL發(fā)光液顯影，Quantity one掃描分析。

5）腦組織病理檢測：提取各糖尿病模型組和對照鼠組的腦組織，固定包埋后，將其制作成載玻片，對于切片觀察，其中的海馬形態(tài)開始發(fā)生改變，觀察海馬CA1區(qū)之中變化最明顯，已經(jīng)形成了老年斑。

6）ChIP和二代基因組測序：提取各糖尿病模型組和對照鼠組的腦組織，肌肉組織，外周血單核細(xì)胞，加入裂解液后進(jìn)行超聲處理，然后加入S9.6抗體，染色質(zhì)共沉淀（ChIP）， 捕獲RNA/DNA雜合體，然后超聲打斷或酶切，送測序公司對DNA純化物進(jìn)行二代測序。分析各樣本中R-loops的形式，富集區(qū)域，GO分析所富集區(qū)域涉及的相關(guān)通路，比較正常樣本與糖尿病樣本，糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥樣本，以及二甲雙胍干預(yù)后樣本間R-loops的差異性。

7）DNA 甲基化測序：提取各糖尿病模型組和對照鼠組的肌肉組織細(xì)胞以及外周血單核細(xì)胞的基因組DNA，分析各樣本中甲基化富集區(qū)域，甲基化形式和富集量，GO分析所富集區(qū)域涉及的相關(guān)通路，比較正常樣本與糖尿病樣本，糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥樣本，以及二甲雙胍干預(yù)后樣本間甲基化的差異性，推測二甲雙胍是否通過R-loops影響相關(guān)基因甲基化程度，進(jìn)而影響DNA的穩(wěn)定性，縱向影響糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥的進(jìn)展。

（三）觀察指標(biāo)

1）???? 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT-22進(jìn)行單獨培養(yǎng)，甲基化抑制劑聯(lián)合培養(yǎng)，對比其R-loops水平，基因甲基化水平的差異，確定R-loops在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)節(jié)基因甲基化水平。對小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT-22進(jìn)行二甲雙胍干預(yù)后，檢測其R-loops水平，基因甲基化水平的改變。

2）???? 通過Qpcr/Western blot驗證相關(guān)差異基因，凋亡通路蛋白表達(dá)，以及Tau蛋白等磷酸化蛋白修飾情況變化，從而探索二甲雙胍是否可以調(diào)節(jié)患者R-loops水平。對Tau蛋白等磷酸化蛋白修飾情況的檢測，確定其變化，驗證二甲雙胍是否可以通過調(diào)節(jié)患者R-loops水平，影響DNA的穩(wěn)定性，改善糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥。

二、結(jié)果

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT-22如果進(jìn)行甲基化抑制劑聯(lián)合培養(yǎng)，就可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的R-loops水平明顯降低，因此使得基因甲基化水平的也明顯下降，確定R-loops在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)，可以調(diào)節(jié)基因甲基化水平。而實驗組的T2D損傷大鼠模型只是對其進(jìn)行二甲雙胍干預(yù)后，檢測發(fā)現(xiàn)實驗組的R-loops水平明顯降低，基因甲基化水平的也明顯下降。

三、討論

糖尿病作為最常見的多病因代謝性疾病，發(fā)病率高，并發(fā)癥多，易引起多器官損傷，且該病發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，目前仍未能完全闡明。阿爾茨海默氏病是一種神經(jīng)退行性疾病，65歲以上的人中約十五分之一的人群有患病風(fēng)險。前期研究表明，60歲以上患有2型糖尿病的人患阿爾茨海默氏癥的可能性是沒有糖尿病的兩倍。糖尿病對供給細(xì)胞和神經(jīng)小細(xì)管的損害，可能是阿爾茲海默癥在糖尿病患者中更普遍的原因之一。R-Loops是由RNA-DNA雜交和DNA移位鏈組成的三鏈結(jié)構(gòu)，研究表明，其與DNA的穩(wěn)定性有關(guān)，引起相關(guān)神經(jīng)退行性病變。二甲雙胍是公認(rèn)的治療糖尿病的一種藥物，而且醫(yī)生也是對于2型糖尿病一直給予二甲雙胍的治療，而二甲雙胍對于阿爾茲海默癥的作用卻出現(xiàn)截然不同的兩種研究推論。因此，本項目旨在討論R-Loops與糖尿病并發(fā)阿爾茲海默癥之間的關(guān)系，二甲雙胍在糖尿病并發(fā)阿爾茲海默中的作用，探探索其可能的分子機(jī)制，究竟二甲雙胍是不是阿爾茲海默癥的罪魁禍?zhǔn)?，糖尿病并發(fā)這個病癥是為什么，以下內(nèi)容將對此進(jìn)行新的理論論述，并探索分子檢測手段等預(yù)警機(jī)制，為糖尿病治療提供用藥指導(dǎo)。

本課題負(fù)責(zé)人在前期的工作中通過臨床病例研究和動物實驗研究，初步觀察到腸道菌群可能通過影響腸/腦軸-神經(jīng)內(nèi)分泌功能在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起作用。隨后，通過高通量測序技術(shù)對比檢測了有無接受糖尿病患者腸道菌群移植的無菌小鼠的腸上皮和腦組織以及糖尿病患者和健康人來源的ips細(xì)胞誘導(dǎo)分化的胰島β細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，初步篩選出宿主生物鐘信號通路的改變可能是腸道菌群影響腸/腦軸-神經(jīng)內(nèi)分泌功能引起糖尿病的分子機(jī)制。以上臨床及基礎(chǔ)研究工作都為本項目的開展提供了堅實的預(yù)實驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] MANO T， NAGATA K， NONAKA T， et al. Neuron-specific methylome analysis reveals epigenetic regulation and tau-related dysfunction of BRCA1 in Alzheimer's disease [J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2017， 114（45）： E9645-E54.

[2] JACKSON K C， GIDLUND E K， NORRBOM J， et al. BRCA1 is a novel regulator of metabolic function in skeletal muscle [J]. Journal of Lipid Research， 2014， 55（4）：668-80.