周 潔，陳 靜，劉琪琪，宗時宇，劉 洋，張 紅，穆 珺，王春柳*，李 曄，

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

疼痛與炎癥常常伴隨多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程［1］。疼痛會從心理、生理、精神等方面嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，已成為全球性的公共健康問題［2-3］。目前，臨床上常用鎮(zhèn)痛藥主要分為阿片受體類鎮(zhèn)痛藥及解熱鎮(zhèn)痛藥；抗炎藥主要有甾體抗炎藥與非甾體抗炎藥。各類鎮(zhèn)痛抗炎藥雖然臨床療效好，但常會出現(xiàn)由于不合理用藥或藥物的不良反應(yīng)引發(fā)各種安全性問題。因此，研發(fā)高效低毒的天然鎮(zhèn)痛抗炎藥物是研究者長期奮斗的目標(biāo)［4］。而中藥目前在鎮(zhèn)痛抗炎活性研究方面已取得了較好的發(fā)展。

駱駝刺（Alhagi sparsifoliaShap，AS）為豆科駱駝刺屬植物的干燥莖枝［5-6］，也是駱駝在沙漠中能夠維持生存的糧食來源，故又被形象的稱為“駱駝草”［7］。駱駝刺被收錄于《新疆主要飼用植物志》和《中國植物志》中［8］。駱駝刺作為維吾爾醫(yī)與藏醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)用民族藥材，資源豐富，分布廣泛，民間應(yīng)用歷史悠久，臨床上主要作為治療牙痛、頭痛、腹痛腹脹等疾病的常用藥［9］。其單方可用于治療各種疼痛疾病，如頭痛、牙痛、寒濕性關(guān)節(jié)炎等；復(fù)方主要在臨床用于慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、咽喉疼痛、腹痛腹瀉等癥的治療。但駱駝刺作為鎮(zhèn)痛抗炎藥用時有效部位不明確，藥效作用機制不清楚，且未見有相關(guān)制劑研究。本實驗將以駱駝刺氯仿提取物（AS chloroform extract，ASE）為研究對象，通過小鼠熱板試驗、醋酸扭體試驗、福爾馬林致痛和二甲苯致耳腫脹試驗進(jìn)行ASE 鎮(zhèn)痛抗炎活性評價，以期為駱駝刺開發(fā)成為鎮(zhèn)痛抗炎藥物奠定一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥

ASE（實驗室自制）；熱板測痛儀（ZH-LB100，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；醋酸（20190307，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；羅通定（20190806，泌陽盤古藥業(yè)有限責(zé)任公司）；吲哚美辛（20190322，上海信誼九福藥業(yè)有限公司）；阿司匹林（20190321，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限公司）。

1.2 動物

SPF 昆明小鼠，體重18～22 g；SD 大鼠，體重180～200 g，均購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（陜）2012-003。

2 方法

2.1 ASE的制備

稱取駱駝刺干燥粗粉2.5 kg 置于圓底燒瓶中，加8 倍70%（v/v）乙醇回流提取2 次，2 h/次，過濾，合并兩次濾液，于40℃減壓濃縮回收乙醇后收集濃縮液；將濃縮液依次用石油醚、氯仿按照1：1（v/v）萃取3 次，合并氯仿層萃取液，于40℃減壓濃縮，揮干溶劑，干燥后稱重得ASE。

2.2 熱板試驗

雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，分組前對小鼠進(jìn)行預(yù)篩選。將熱板溫度設(shè)定為55±0.1℃，記錄小鼠足部自接觸熱板至出現(xiàn)舔后足、跳躍等行為的潛伏時間，作為痛閾指標(biāo)。小鼠的正常痛閾一般在5～30 s，篩選合格小鼠，每只小鼠間隔20 min 測定一次，計算3 次測定結(jié)果的平均值記為正常痛閾。取合格小鼠30 只，隨機分為5 組，6 只/組，分別為生理鹽水組（20 mL·kg-1）、羅通定陽性藥對照組（0.02 g·kg-1）、ASE 高、中、低劑量組（1.00、0.50、0.25 g·kg-1）。連續(xù)灌胃給藥7 d，并于末次給藥后30、60、90 和120 min分別測定小鼠的痛閾值［10-11］。

2.3 醋酸扭體試驗

昆明小鼠雌雄各半，并隨機分為5 組，10 只/組，分別為羧甲基纖維素鈉對照組（1% CMC-Na，10 mL·kg-1）、吲哚美辛陽性藥對照組（0.01 g·kg-1）、ASE高、中、低劑量組（1.00、0.50、0.25 g·kg-1），按照各組給藥劑量，小鼠連續(xù)灌胃給藥7 d，最后一次給藥后1 h，腹腔注射0.2 mL 0.6%的醋酸，以小鼠腹部內(nèi)凹和伸后足的扭體反應(yīng)為評價指標(biāo)，觀察并記錄15 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)作為痛閾指標(biāo)，并計算抑制率（%）［12］。

2.4 福爾馬林試驗

昆明小鼠50 只，隨機分為5 組，10 只/組，分別為羧甲基纖維素鈉對照組（1% CMC-Na，10 mL·kg-1）、吲哚美辛陽性藥對照組（0.01 g·kg-1）、ASE高、中、低劑量組（1.00、0.5、0.25 g·kg-1），除吲哚美辛陽性藥對照組外，其余組均按照上述劑量連續(xù)灌胃給藥5 d。陽性藥對照組于第3 天開始按照20 mL·kg-1給藥0.65 mg·kg-1吲哚美辛混懸液1 次。末次給藥后1 h，按照20 mL·kg-1于小鼠右后足足底皮下注射2%福爾馬林溶液，觀察并記錄給藥后神經(jīng)疼痛期（第Ⅰ時相，0～10 min）與炎癥疼痛期（第Ⅱ時相，15～30 min）兩時相小鼠舔舐皮下注射足的累積時間，作為不同時相疼痛強度的評價指標(biāo)［13-14］。

2.5 二甲苯致耳腫脹試驗

昆明小鼠雌雄各半，隨機分為5 組，每組10 只，分別為羧甲基纖維素鈉對照組（1% CMC-Na，10 mL·kg-1）、阿司匹林陽性藥對照組（0.01 g·kg-1）、ASE高、中、低劑量組（1.00、0.50、0.25 g·kg-1），按照上述劑量小鼠連續(xù)灌胃給藥5 d，末次給藥1 h后，每只小鼠一只耳朵的正反兩面各均勻涂抹二甲苯20 μL 致炎，30 min后處死小鼠，剪下雙耳，重疊后用6 mm 打孔器打出圓形耳片并稱重，計算腫脹度［15-16］。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ASE對熱板致痛模型的影響

由圖1 可得，給藥30 min 時，陽性藥組與ASE高、中、低劑量組對熱刺激致痛均未顯示出鎮(zhèn)痛作用；在給藥后的60～120 min 中，ASE 中、高劑量組的痛閾值明顯延長，與基礎(chǔ)痛閾值相比，均顯示出統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），表明ASE 中、高劑量對熱刺激引發(fā)的疼痛抑制作用顯著，顯示ASE 具有一定的中樞鎮(zhèn)痛作用。

圖1 不同時間點小鼠熱板試驗痛閾值（-x±s，n=6）Fig.1 Pain thresholds of mice in hot plate experiment at different time points

3.2 ASE對醋酸刺激痛模型的影響

由表1、圖2 可知，CMC-Na 組給藥后的扭體次數(shù)為（46.2±15.5）次，ASE的低、中和高劑量組的扭體次數(shù)分別為（28.0±8.9）次、（31.3±8.8）次與（24.5±5.3）次。由統(tǒng)計分析結(jié)果可得，與模型組相比，ASE低、中、高劑量組對減少由醋酸所致疼痛模型小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均有顯著性差異（P＜0.05），其抑制率分別為39.76%、32.72%和47.23%，陽性藥的抑制率可達(dá)67.88%（P＜0.001）。

表1 不同給藥組對醋酸刺激痛的影響（-x±s，n=10）Table1 Effects of different administration groups on pain stimulated by acetic acid（-x±s，n=10）

圖2 不同給藥組對醋酸致扭體次數(shù)的影響（-x±s，n=10）Fig.2 Influence of different administration groups on the number of acetic acid torsion（-x±s，n=10）

3.3 ASE對福爾馬林致痛模型的影響

由表2、圖3 可知，CMC-Na 組第Ⅰ、Ⅱ時相小鼠 的 舔 足 持 續(xù) 時 間 分 別 為（76.45±8.22）s 和（84.18±8.09）s，ASE 的中、高劑量組均可縮短福爾馬林致疼痛反應(yīng)的第Ⅰ、Ⅱ時相小鼠累積舔足時長（P＜0.05），中劑量組兩時相舔足持續(xù)時間分別為（41.81±2.45）s 和（56.82±5.50）s，其抑制率分別為45.31%和32.50%；高劑量組兩時相舔足持續(xù)時間分別為（49.82±5.48）s 和（50.33±7.85）s，其抑制率分別為34.83%和40.21%。陽性藥吲哚美辛僅在第Ⅱ時相對福爾馬林致痛模型顯示抑制作用（P＜0.05），表明吲哚美辛僅對炎性致痛期有抑制作用。

表2 不同給藥組對福爾馬林致疼痛反應(yīng)的影響（-x±s，n=10）Table2 Influence of different administration groups on pain response induced by formalin（-x±s，n=10）

圖3 不同給藥組對福爾馬林致疼痛反應(yīng)的影響（-x±s，n=10）Fig.3 Effects of different administration groups on formalin-induced pain response（-x±s，n=10）

3.4 ASE對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

由圖4可知，正常小鼠耳廓經(jīng)二甲苯刺激后，明顯腫脹，表明已造模成功。與模型組相比，ASE 中、高劑量組均可使耳腫脹度顯著減?。≒＜0.001），表明其抗炎作用呈一定的劑量依賴性。

圖4 不同給藥組對二甲苯致耳腫脹的影響（-x±s，n=10）Fig.4 Influence of different administration groups on ear swelling induced by xylene（-x±s，n=10）

4 討論

疼痛是一種由現(xiàn)存的或潛在的組織損傷所引發(fā)的機體心理和生理不舒適的感覺［17］，常常會給患者身體和精神上帶來巨大影響［18］。疼痛會導(dǎo)致患者生活質(zhì)量低下及機體生理功能紊亂，也是對機體所處外界環(huán)境或機體不良狀態(tài)時的自我保護(hù)反應(yīng)。炎癥是一種常見的組織器官的病理過程，是機體自身與致炎因子兩者之間斗爭的結(jié)果，炎癥發(fā)生的同時也常常會伴隨著發(fā)熱、腫痛和疼痛等反應(yīng)［19-20］。

駱駝刺作為維吾爾醫(yī)與藏醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)用民族藥材，臨床上主要用于治療各種疼痛性疾病。據(jù)報道，駱駝刺中的主要成分為黃酮類化合物，其中包括異鼠李素、山奈素、芒柄花素、槲皮素等，是駱駝刺中主要發(fā)揮藥效的物質(zhì)。

課題組前期研究表明駱駝刺氯仿提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性最好，并利用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)對ASE 進(jìn)行了化合物成分，共解析出異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素等10 個化合物，發(fā)現(xiàn)ASE 中的主要成分為黃酮類化合物［21］?，F(xiàn)代藥理研究表明，槲皮素可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的產(chǎn)生，顯著提高TLR（Toll like receptor，TLR）信號負(fù)調(diào)節(jié)因子Toll 相互作用蛋白的表達(dá)，達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的療效［22］?？寡讬C制通路中，一氧化氮在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，黃酮類化合物可通過影響環(huán)磷酸鳥苷水平，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活化，影響多種炎癥因子的表達(dá)，達(dá)到抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和一氧化氮產(chǎn)生的作用［23］。因此我們推測可能黃酮類化合物與鎮(zhèn)痛抗炎作用有關(guān)。

因此，本試驗通過建立了4 種經(jīng)典疼痛及炎癥動物模型來評價ASE 的鎮(zhèn)痛抗炎作用。結(jié)果表明，駱駝刺氯仿部位提取物可以有效緩解二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹，具有顯著抗炎作用；可以減輕醋酸誘導(dǎo)的小鼠扭體反應(yīng)和福爾馬林誘導(dǎo)駱駝刺氯仿部位提取物的鎮(zhèn)痛效果。該結(jié)果充分證明了ASE具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎活性，為駱駝刺氯仿提取物開發(fā)為潛在的抗炎鎮(zhèn)痛藥物提供了理論基礎(chǔ)。