于雯雯，秦蘇楊，王耀光

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381）

慢性腎臟?。–KD）現(xiàn)今已成為一種嚴(yán)重危害人類生命健康的慢性疾病。腎間質(zhì)纖維化（RIF）是各種CKD發(fā)展至終末期腎病的共同通路，是CKD的主要病理表現(xiàn)[1]。近年來，隨著肥胖、糖尿病、高血壓的增多[2]，CKD的發(fā)病率也普遍上升[3]，RIF人數(shù)也隨之增長。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，延緩RIF進(jìn)展可有效保護(hù)尚未損壞的腎功能，對CKD的治療有重要意義。

中醫(yī)藥在治療腎臟病中積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。腎疏寧是黃文政教授以“疏利少陽三焦”為主要治則，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科多年臨床實(shí)踐研究，篩選組合而創(chuàng)的中藥復(fù)方[4]，由柴胡，黃芪，黃芩，丹參，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草組成?，F(xiàn)代藥理研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，腎疏寧能改善腎小球系膜功能和腎小管的通透性，優(yōu)化蛋白質(zhì)的代謝[7]。王耀光教授臨床實(shí)踐[8]證明腎疏寧方能明顯改善患者的臨床癥狀、部分肝腎功能指標(biāo)，并能減少尿蛋白，對CKD有一定療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過網(wǎng)絡(luò)和軟件分析來預(yù)測中藥的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥研究提供了一種新的思維方式，使中藥多成分、多靶點(diǎn)的治療特點(diǎn)在臨床治療中能充分發(fā)揮其優(yōu)勢[9]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，結(jié)合分子對接技術(shù)，以分析腎間質(zhì)纖維化高度相關(guān)的信號通路為主，探討腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，以期為臨床運(yùn)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 腎疏寧相關(guān)靶點(diǎn)篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索腎疏寧中（柴胡，黃芪，黃芩，丹參，鬼箭羽，山茱萸，萹蓄，白花蛇舌草，益母草）9味中藥的化學(xué)成分[10]，TCMSP數(shù)據(jù)庫設(shè)定口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，初步篩選出活性成分及作用靶點(diǎn)，并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。借助Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）將化合物的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)與其基因名進(jìn)行對應(yīng)匹配；建立腎疏寧化學(xué)成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.2 腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過檢索 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www．genecards．org）、藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TTD，http：//bidd．nus．edu．sg/group/cjttd）、在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//www．omim．org），以“Renal Interstitial Fibrosis”為關(guān)鍵詞，檢索出防治疾病的潛在靶點(diǎn)。合并所有疾病數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)刪除重復(fù)值得到最終疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將兩者靶點(diǎn)進(jìn)行映射并繪制韋恩圖。

1.3 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape3．8．0構(gòu)建腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度（Degree）、介度（Betweenness Centrality）及緊密度（Closenesss Centrality）等，最后根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.4 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了找出藥物與疾病靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，將兩者交集靶點(diǎn)進(jìn)行互作分析，利用Cytoscape3．8．0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

1.5 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化功能與通路的富集分析 將腎疏寧防治RIF的靶點(diǎn)錄入DAVID Bioinformatics Resources 6．8 平臺，設(shè)定 P＜0．05，進(jìn)行基因本體論（GO）生物學(xué)過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析，根據(jù)P值FDR值大小排序，并選取排名高的信號通路通過在線繪圖網(wǎng)站bioinformatics（http：//www．bioinformatics．com．cn）將其結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)；并構(gòu)建腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)的分子對接 將腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中度值，介度，緊密度高的活性成分通過ZINC（http：//zinc．docking．org）網(wǎng)站查找其3D結(jié)構(gòu)。將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)從PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www．rcsb．org/）中找出其 3D 結(jié)構(gòu)，通過 AutoDock Tools 1．5．6逐一對接，只保留Affinity（kcal/mol）絕對值最高的對接結(jié)果，并用R語言繪制熱圖。再利用Pymol軟件進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 腎疏寧活性成分靶點(diǎn)獲取 初步提取腎疏寧的中藥成分，篩選得到有效成分柴胡17種，黃芪20種，黃芩36種，丹參65種，鬼箭羽8種，山茱萸20種，萹蓄2種，白花蛇舌草7種，益母草8種。得出每味藥物成分的作用靶點(diǎn)，柴胡88個，黃芪98個，黃芩62個，丹參74個，鬼箭羽82個，山茱萸42個，萹蓄69個，白花蛇舌草88個，益母草100個，合并刪除重復(fù)值后得到靶點(diǎn)232個。根據(jù)OB和DL高低篩選出主要活性成分為山柰酚、槲皮素、異鼠李素、豆甾醇等（見表1）。

表1 腎疏寧主要活性成分的基本信息Tab.1 Basic information of main active components of Shenshuning

2.2 腎間質(zhì)纖維化相關(guān)靶點(diǎn)獲取 從Genecards數(shù)據(jù)庫找出疾病靶點(diǎn) 2 783個，設(shè)定 Score＞5．3（中位數(shù)）。并結(jié)合OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并刪除重復(fù)值后得到1 371個相關(guān)靶點(diǎn)。將篩選的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，得到中藥藥物成分-疾病共同靶點(diǎn)116個（見圖1）。

圖1 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of the components of Shenshuning-RIF target

2.3 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用CytoScape3．8．0構(gòu)建腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。中藥與疾病相關(guān)的活性成分130個，包含中藥共有成分10個（見表2），藥物獨(dú)有成分丹參56個、黃芩28個、柴胡8個、山茱萸8個、黃芪14個、白花蛇舌草1個、益母草4個、鬼箭羽1個、扁蓄0個。并分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，其中排名前8的成分依次為槲皮素、矮牽牛素、異鼠李素、花生四烯酸、山奈酚、丹參酮、聯(lián)苯酸脂、豆甾醇（見表3）。

圖2 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖表Fig.2 Target network of the components of Shenshuning-RIF target

表2 腎疏寧不同藥物的相同活性成分Tab.2 The same active components of different drugs of Shenshuning

腎間質(zhì)纖維化的主要病理過程包括：上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、血管緊張素系統(tǒng)活性升高及各種細(xì)胞因子間的相互作用等[14]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)提交至STRING11.0平臺，利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3），并根據(jù)其degree值將其可視化（見圖4）。腎疏寧治療RIF的主要潛在靶點(diǎn)為腫瘤壞死因子（TNF），蛋白激酶B1（AKT1），JUN，絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1），RELA，TP53。

圖3 腎疏寧成分-腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of the components of Shenshuning-RIF target

圖4 腎疏寧治療腎間質(zhì)纖維化主要靶點(diǎn)可視化Fig.4 Visualized bar chart of degree value of targets of Shenshuning in the treatment of RIF

2.5 富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)平臺對腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，通過在線繪圖網(wǎng)站bioinformatics以及R語言將其結(jié)果進(jìn)行可視化呈現(xiàn)（見圖5）。GO富集結(jié)果表明腎疏寧治療疾病可能通過炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。KEGG分析結(jié)果顯示這些靶點(diǎn)主要富集映射在 TNF、NF-κB、AGE-RAGE 等高度相關(guān)的信號通路（見圖6、表4）。并以前25條通路構(gòu)建腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（見圖7）。

圖5 腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)GO分析Fig.5 GO analysis of the target point of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

圖6 腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)KEGG分析Fig.6 KEGG analysis of the target point of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

圖7 腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Target-pathway network of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

表4 腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化靶點(diǎn)通路富集結(jié)果Tab.4 Enrichment results of target pathway of Shenshuning in the prevention and treatment of RIF

2.6 分子對接 結(jié)果顯示有效活性成分豆甾醇、丹參酮、異鼠李素與核心靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合活性；核心靶點(diǎn)TNF、RELA與有效成分的結(jié)合活性較好（見圖8）。同時借助Pymol2.5.0軟件分別對山奈酚與TNF，異鼠李素與TNF，豆甾醇與TNF，丹參酮與TNF，異鼠李素與RELA，豆甾醇與RELA進(jìn)行分子對接可視化（見圖9）。

圖8 腎疏寧中的關(guān)鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接熱圖Fig.8 Heat map of the docking between key active compounds and PPI core target protein in Shenshuning

圖9 腎疏寧中關(guān)鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接Fig.9 Docking of key active compounds and PPI core target protein in Shenshuning

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是CKD的病理標(biāo)志和主要表現(xiàn)[1]。依據(jù)其臨床癥狀及發(fā)病特點(diǎn)，中醫(yī)可歸屬于“水腫”“癃閉”“關(guān)格”“虛勞”“腎風(fēng)”等病證范疇[11-12]。黃文政教授認(rèn)為濕熱內(nèi)蘊(yùn)是本病的主要病機(jī)，腎疏寧是在以“少陽主樞”“三焦氣化”為理論指導(dǎo)創(chuàng)立的，以疏利少陽為主要治則，并兼有補(bǔ)腎氣、降瘀濁、解濕毒的功效。方中柴胡、黃芩為主，樞利少陽三焦?jié)駸?；黃芪、益母草、山萸肉益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)肝腎；丹參、鬼箭羽、萹蓄、白花蛇舌草等清濕熱活血解毒。諸藥搭配，疏利少陽，扶正祛邪[13]。理學(xué)對中藥復(fù)方深入分析挖掘，闡述腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化在整體分子水平上的作用機(jī)制[15]，研究結(jié)果顯示腎疏寧可作用于RIF的中藥活性成分有130種，相關(guān)作用靶基因116個。KEGG分析結(jié)果顯示腎疏寧防治腎間質(zhì)纖維化主要作用與TNF、NF-κB、AGE-RAGE 等信號通路有關(guān)，尤以 TNF、NF-κB通路密切相關(guān)。

TNF-α是參與腎間質(zhì)纖維化重要的炎癥因子之一，能夠有效刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞，誘導(dǎo)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化或凋亡，加速腎間質(zhì)纖維化發(fā)展。TNF-α還能通過刺激NF-κB通路將其活化誘導(dǎo)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[16]。被激活的NF-κB反過來促進(jìn)TNF-α的形成，使NF-κB與TNF-α形成反饋環(huán)[17]。NF-κB作為炎性反應(yīng)基因，在腎小球細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[18]，被激活后能產(chǎn)生更多的炎性因子，發(fā)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展。另外，NF-κB還可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，也可導(dǎo)致纖維化形成。AGE-RAGE信號通路是通過促進(jìn)腎臟的炎癥反應(yīng)和纖維化過程，促使腎臟結(jié)構(gòu)損傷，最終導(dǎo)致腎功能喪失。AGE-RAGE通路可通過誘導(dǎo)NF-κB的激活和氧化應(yīng)激作用，進(jìn)一步刺激促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的表達(dá)隨著NF-κB的活化而升高[14]，TGF-β1目前被認(rèn)為是腎間質(zhì)纖維化過程中最關(guān)鍵的生長因子之一，TGF-β1是EMT過程的主要誘導(dǎo)因子，對腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)有重要影響。通過研究可得腎疏寧可能主要通過調(diào)節(jié)TNF蛋白靶點(diǎn)激活NF-κB通路，減少炎性因子和纖維形成因子產(chǎn)生[15]，同時也會調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路，從而減少肌成纖維細(xì)胞數(shù)量，調(diào)節(jié)ECM的表達(dá)，減少細(xì)胞炎性損傷，抑制炎癥反應(yīng)和纖維化過程，起到治療腎間質(zhì)纖維化的作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證腎疏寧對RIF治療作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對腎疏寧的核心化合物與TNF、RELA進(jìn)行分子對接分析，可見核心活性化合物均能與TNF、RELA通過氫鍵等作用穩(wěn)定結(jié)合。氫鍵是穩(wěn)定對接體系的重要作用力[19]，核心活性化合物與TNF、RELA結(jié)合均有氫鍵形成。一般認(rèn)為，結(jié)合能絕對值大于5 kcal/mol表明化合物與靶點(diǎn)蛋白之間結(jié)合活性較好；絕對值大于7.0 kcal/mol表明小分子與受體蛋白具有很強(qiáng)的結(jié)合活性[20]。分子對接結(jié)果顯示山奈酚與TNF結(jié)合能絕對值為8 kcal/mol，丹參酮與TNF結(jié)合能絕對值為8.3 kcal/mol，異鼠李素與TNF結(jié)合能絕對值為8.3 kcal/mol，異鼠李素與RELA結(jié)合能絕對值為8.3 kcal/mol。值得一提的是，豆甾醇與TNF結(jié)合能絕對值為10 kcal/mol，豆甾醇與RELA結(jié)合能絕對值為9.7 kcal/mol。根據(jù)研究結(jié)果考慮豆甾醇在調(diào)節(jié)RIF過程中發(fā)揮重要作用。湯利華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚可降低TNF-α等的表達(dá)，使炎性細(xì)胞浸潤降低，緩解腎組織損傷。研究結(jié)果顯示丹參酮可通過改變TGF-β/Smad和NF-κB通路的表達(dá)來抑制RIF和炎癥反應(yīng)[22]。田鋒等[23]認(rèn)為異鼠李素其作用機(jī)制可能是抑制了NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的過度活化及氧化應(yīng)激。同時腎疏寧中多種活性成分都對RELA表達(dá)產(chǎn)生影響，通過抑制NF-κB的蛋白表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到防治腎間質(zhì)纖維化的目的。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，分析了腎疏寧治療腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，揭示了腎疏寧防治RIF可能的相關(guān)信號通路、靶點(diǎn)蛋白及活性化合物，為臨床慢性腎臟病的防治和后續(xù)深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方式存在局限性、中藥復(fù)方較復(fù)雜、藥物間相互作用不明確及體內(nèi)代謝差異等的影響，無法明確中藥成分的全部藥理作用，還需要臨床試驗(yàn)和動物試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。