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        新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對木材結(jié)構(gòu)及酶解的影響?

        2022-04-20 08:31:20曹舒祺陳夢婕侯賢鋒
        林產(chǎn)工業(yè) 2022年4期

        曹舒祺 陳夢婕 侯賢鋒 孫 瑾

        (華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院,廣東 廣州 510642)

        木質(zhì)纖維素是重要的再生資源,對于緩解能源緊缺壓力和解決環(huán)境污染問題有重要意義[1-2]。然而,木質(zhì)纖維素具有獨特的保護性壁壘結(jié)構(gòu)[3-4],阻礙了其生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,因而難以直接利用。因此,需要通過物理法、化學(xué)法和微生物法[5]對木質(zhì)纖維素進行預(yù)處理。物理法主要是減小樣品顆粒尺寸,改變木質(zhì)原料的結(jié)構(gòu),不會去除非纖維素部分(木質(zhì)素和半纖維素等),且所需能耗和成本較高[6-7]。化學(xué)法主要是通過化學(xué)試劑破壞木質(zhì)素和半纖維素的結(jié)構(gòu),從而暴露出纖維素,增加其可及性。然而,化學(xué)處理不僅會污染環(huán)境,還會產(chǎn)生副產(chǎn)物,抑制后續(xù)發(fā)酵過程[8-9]。

        微生物法是一種環(huán)保、溫和且低成本的預(yù)處理方法[10-11],可以有效避免物理法和化學(xué)法存在的問題,具有良好的應(yīng)用前景。微生物法主要包括真菌預(yù)處理和細菌預(yù)處理兩種方式[12-13]。相比于真菌,細菌生長迅速,具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力,生長過程對pH和溫度要求較低,同時可產(chǎn)生多種酶,增強預(yù)處理效果[14]。目前,用于預(yù)處理的細菌有梭菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬等[15-19]。Bahiru等[20]從白蟻體內(nèi)分離出水稻蒼白桿菌 BMP03 和芽孢桿菌 BMP01,用于稻草秸稈的預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素去除率可達53.74%,還原糖產(chǎn)量提高了69.96%。目前,細菌預(yù)處理研究主要集中于稻草秸稈[20-21]和玉米秸稈[1,17]等農(nóng)業(yè)廢棄物,對木材結(jié)構(gòu)及酶解效果的影響尚不清楚。

        本研究采用新鞘氨醇單胞菌分別對針葉材(馬尾松)和闊葉材(尾葉桉)進行處理。通過化學(xué)成分分析、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析、X射線衍射(XRD)分析、掃描電子顯微鏡(SEM)觀察、水解糖化測試,研究新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對兩種木材化學(xué)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)、酶解效率等的影響,以期為細菌預(yù)處理木材研究提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        尾葉桉(Eucalyptus urophylla)和馬尾松(Pinus massoniana)木粉購自廣東省云浮市。將木粉在90 ℃的條件下烘干8 h,而后經(jīng)行星式球磨機熱磨,用分篩機分選200目樣品備用。新鞘氨醇單胞菌(Novosphingobiumsp.)購自廣東省微生物保藏中心,序列號為GIM 1.338。本試驗中所用化學(xué)試劑均為分析純。

        Spectrum 100 傅里葉變換紅外光譜(PerkinElmer,美國),Ulitma IV X射線衍射儀(Rigaku,美國)S-570 掃描電子顯微鏡(Zeiss,德國),UV-5800 紫外分光光度計(上海元析),DGL-35B高壓滅菌鍋(上海力辰),pHS-3C pH計(上海儀電)。

        1.2 菌種培養(yǎng)

        在30 ℃,120 r/min的搖床中進行新鞘氨醇單胞菌的培養(yǎng),所用的培養(yǎng)基為溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB)和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,預(yù)處理試驗所用的培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基。其中,LB培養(yǎng)基的成分為:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,蒸餾水1 L。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分為:牛肉膏3 g/L,NaCl 5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,蒸餾水1 L。無機鹽培養(yǎng)基為:(NH4)2SO42 g/L,K2HPO41 g/L,MgSO40.2 g/L,CaCl20.1 g/L,F(xiàn)eSO40.05 g/L,MnSO40.02 g/L,KH2PO41 g/L,蒸餾水1 L。上述培養(yǎng)基均用1 M的NaOH溶液調(diào)pH值至7.0~7.2。在溫度為121 ℃的高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20~30 min。將新鞘氨醇單胞菌接種到滅菌的LB培養(yǎng)基中,在溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床內(nèi)培養(yǎng)18 h后,用紫外分光光度儀測定600 nm處菌液的光密度值(OD),待菌液的OD值達到1.0時,可用于預(yù)處理試驗。

        1.3 細菌預(yù)處理

        在500 mL的三角瓶內(nèi)配制200 mL的無機鹽培養(yǎng)基,將pH調(diào)至7.0~7.2。分別稱取2 g的尾葉桉和馬尾松木粉,裝入離心管中,放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌。待無機鹽培養(yǎng)基冷卻至室溫時,取20 mL OD值達到1.0的菌液,加入含有木粉的無機鹽培養(yǎng)基中。放入溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床內(nèi),待第5 d時取出,用于后續(xù)測試和分析。

        1.4 酶促水解

        稱取處理過和未處理的木粉各0.1 g,纖維素酶30 mg,20 mL pH為4.8的檸檬酸鈉緩沖液。放入溫度為50 ℃,轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床內(nèi),72 h后取出,用3,5-二硝基水楊酸法 (DNS) 測糖產(chǎn)量。

        1.5 分析方法

        1.5.1 化學(xué)成分分析

        采用范式洗滌法測量樣品的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量。即用酸性洗滌劑和中性洗滌劑洗滌樣品獲得酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)。將ADF經(jīng)5 mL 72%硫酸溶液酸浸3 h,而后加入45 mL蒸餾水過夜,即獲得酸不溶木質(zhì)素(ADL)。將ADL在550 ℃馬弗爐內(nèi)燒制2.5 h,即可獲得灰分。上述NDF和ADF的差值,ADF和ADL的差值,ADL和灰分的差值分別為半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量。

        1.5.2 FT-IR測試

        采用FT-IR觀察處理前后木粉化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。將待測樣品和KBr粉末按1∶100的比例混合均勻,壓制成片后進行掃描,波長范圍4 000~400 cm-1,分辨率為4 cm-1。

        1.5.3 XRD測試

        采用XRD觀察處理前后木粉的結(jié)晶度變化,掃描范圍10°~45°,掃描速度8°/min。結(jié)晶度(CrI)計算按照Segal公式計算:

        式中:I002為2θ=22.48°的強度值;Iamp為2θ=18.50°的強度值。

        1.5.4 SEM表征

        采用SEM觀察處理前后木粉樣品表面微觀結(jié)構(gòu)的變化。測試前,需要對樣品進行噴金處理,以免測試過程對樣品表面結(jié)構(gòu)造成損傷。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 化學(xué)成分分析

        如表1所示,經(jīng)過新鞘氨醇單胞菌處理后,兩種木材的木質(zhì)素含量均降低。這是因為新鞘氨醇單胞菌通過降解木質(zhì)素將其作為自身生長所需的碳源,同時對木質(zhì)素產(chǎn)生一定的礦化作用[22]。木質(zhì)素含量的降低意味著纖維素表面的保護壁壘降解,這將有利于提高纖維素的可及性,從而增強其酶解效率。經(jīng)計算,預(yù)處理后,尾葉桉的木質(zhì)素含量下降了13.6%,而馬尾松木質(zhì)素含量僅下降了6.4%,表明新鞘氨醇單胞菌對闊葉材預(yù)處理效果高于針葉材。

        表1 預(yù)處理前后尾葉桉和馬尾松樣品中主要化學(xué)成分Tab.1 The chemical composition of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

        2.2 FT-IR分析

        圖1為處理前后馬尾松和尾葉桉木粉的紅外光譜圖。預(yù)處理前,兩種樹種顯示出不同的特征峰,主要源于其木質(zhì)素結(jié)構(gòu)差異[23]。細菌預(yù)處理后,這兩種樹種的特征峰變化顯著且較為相似。

        圖1 處理前后尾葉桉和馬尾松FT-IR圖譜Fig.1 The FT-IR spectra of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

        由圖1可知,經(jīng)新鞘氨醇單胞菌處理后,木質(zhì)素的特征峰強度明顯降低。如3 400 cm-1代表羥基中O--H的伸縮振動[24],該處特征峰強度降低,表明木材中部分木質(zhì)素和多糖被降解。1 650、1 507 cm-1和1 460 cm-1處特征峰分別代表具有芳香結(jié)構(gòu)的共軛木質(zhì)素側(cè)鏈上烷基的C==O,芳香環(huán)骨架C==C的伸縮振動和紫丁香基基團的甲基和亞甲基的變形[25]。經(jīng)過預(yù)處理后,這些特征峰強度均有所減弱,表明木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。也就是說,細菌預(yù)處理破壞了木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的破壞有利于削弱木質(zhì)素對纖維素的保護作用,促進纖維素酶的進入,從而提高酶解效果。值得注意的是,由圖1可知,預(yù)處理的尾葉桉在1 375 cm-1(表示愈創(chuàng)木基和紫丁香基的縮合,以及紫丁香基CH2彎曲振動[21,26])處的特征峰強度減弱,這種情況在馬尾松的紅外圖譜中并不明顯。這表明,新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對尾葉桉中木質(zhì)素的破壞更嚴重,這與化學(xué)成分分析結(jié)果一致。

        2.3 XRD分析

        在XRD衍射譜中,22.48°被視為I002晶面,18.50°被視為無定形區(qū)。由圖2可知,兩種木材預(yù)處理前后的XRD峰形均未發(fā)生明顯變化。通過計算可知,尾葉桉的結(jié)晶度為55.34%,預(yù)處理后結(jié)晶度上升至56.49%;馬尾松的結(jié)晶度為47.68%,預(yù)處理后結(jié)晶度上升至53.52%。結(jié)晶度的增加是由于細菌預(yù)處理去除了無定形部分(木質(zhì)素),使得結(jié)晶纖維素的比例相對增大[27-28]。這表明新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理破壞了針葉材(馬尾松)和闊葉材(尾葉桉)的非結(jié)晶區(qū)。

        圖2 預(yù)處理前后尾葉桉和馬尾松X射線衍射圖譜Fig.2 The XRD pattern of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

        2.4 SEM分析

        如圖3所示,預(yù)處理后兩種木材的形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化。處理前,兩種木材樣品的表面均呈現(xiàn)連續(xù)、平整的形態(tài)(圖3a、c),而在預(yù)處理后木材樣品表面可觀察到孔洞、溝槽等明顯的形態(tài)變化(圖3b、d)。這主要是因為細菌預(yù)處理降解并礦化了部分木質(zhì)素,導(dǎo)致原本光滑連續(xù)的表面出現(xiàn)了許多裂紋,使包裹于其中的纖維素暴露[22]。此外,通過對比處理后的馬尾松和尾葉桉樣品,可以發(fā)現(xiàn),尾葉桉的表面破損更為嚴重(3b、d),這與上述的成分分析和FT-IR的結(jié)論一致。

        圖3 預(yù)處理前后木材樣品掃描電鏡圖Fig.3 The SEM of Eucalyptus urophylla and Pinus massoniana before and after pretreatment

        2.5 酶解效果

        為探討新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對這兩種木材的酶解效果的影響,對預(yù)處理前后的尾葉桉和馬尾松進行了酶促水解糖化研究,結(jié)果如表2所示。未處理尾葉桉產(chǎn)生的還原糖為186.4 mg/g,預(yù)處理后還原糖為236.5 mg/g。馬尾松預(yù)處理后,其還原糖產(chǎn)量從287.9 mg/g增加到315.1 mg/g。這說明,預(yù)處理后針葉材和闊葉材的酶促水解效果均得到提高。根據(jù)計算,預(yù)處理后尾葉桉和馬尾松的還原糖產(chǎn)量分別提高了26.9%和9.4%??梢姡虑拾贝紗伟A(yù)處理對尾葉桉的作用效果更加明顯,使其微觀結(jié)構(gòu)破壞更嚴重,從而使得尾葉桉的酶解效果提升更為顯著。

        表2 預(yù)處理前后木材樣品的糖轉(zhuǎn)化率Tab.2 The reduce sugar yield of wood sample before and after pretreatment

        3 結(jié)論

        本研究采用新鞘氨醇單胞菌處理針葉材和闊葉材樣品,分析了預(yù)處理前后木材的化學(xué)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)及酶解效率變化。結(jié)果表明,預(yù)處理后兩種木材的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)均被破壞,致使木材的結(jié)晶指數(shù)增大,同時木材表面出現(xiàn)裂紋、孔洞、溝槽等現(xiàn)象,增加了纖維素的可及性,從而提高了木材的酶解效果。相對于針葉材,新鞘氨醇單胞菌預(yù)處理對闊葉材的木質(zhì)素及微觀結(jié)構(gòu)破壞更為明顯。本研究可為木材的細菌預(yù)處理提供參考。

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