徐雅雯，陳如意，張 樂，郭志平，李嘉誠，朱群茵

（1.麗水學(xué)院 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000；2.麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

中華獼猴桃（Actinidia chinensis），也稱奇異果，是一種品質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富、風(fēng)味鮮美的水果。在植物內(nèi)部的各種器官和組織中分布有不同含量的黃酮類化合物。而黃酮類化合物作為獼猴桃果實(shí)內(nèi)主要的活性成分，也是果實(shí)中最主要的多酚類物質(zhì)，具有多種生物和藥理活性，可以起到抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[1]。黃酮類物質(zhì)合成途徑分支點(diǎn)的核心酶眾多，其中黃烷酮3- 羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）的主要作用為催化4，5，7，- 黃烷酮C 位的羥化，從而生成花青素、前花色素苷、黃酮醇的前體物質(zhì)——二氫山奈素（dihydrok-aempferol，DHK）[2-3]。雖然F3H可以單獨(dú)調(diào)控代謝，但是在黃酮類化合物的合成過程中F3H常和該途徑查爾酮異構(gòu)酶、查爾酮合成酶等合作[4-6]。F3H基因的克隆和代謝早已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）[7]、水稻（Oryza sativa）[3]和其他物種中有報(bào)道，但在中華獼猴桃中還沒有關(guān)于F3H基因克隆的報(bào)道。因此本研究采取RT-PCR 克隆中華獼猴桃F3H基因cDNA 序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究中華獼猴桃中F3H基因結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

從麗水府前農(nóng)貿(mào)市場購買重量相等、大小一致、形狀相似、成熟程度一致的新鮮中華獼猴桃。

1.2 中華獼猴桃總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

總RNA 的提取參照梅曉宏[8]的方法。取新鮮中華獼猴桃果實(shí)在液氮中研磨成粉，加入異硫氰酸胍提取劑，再加入醋酸鉀、100%冰乙醇及1/10 體積的醋酸鈉，顛倒混勻，再加入水飽和酚及氯仿- 異戊醇，混勻，離心取上清；加入異戊醇，于-20 ℃沉淀，離心；加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，用適量的DEPC 水溶解RNA，隨后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以提取得到的總RNA 為模板，采用碧云天BeyoRTTMⅢcDNA 合成預(yù)混液（5X）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取Total RNA 1 μL、DEPC-treated Water 6 μL、BeyoRTTMⅢcDNA 合成預(yù)混液（5X）4 μL形成20 μL 的反應(yīng)體系；隨后42 ℃下孵育30 min，80 ℃下孵育10 min，獲取cDNA 第一鏈。

1.3 中華獼猴桃F3H 基因cDNA 克隆

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中華獼猴桃F3H基因cDNA 序列（登錄號(hào)：FJ542819），分別設(shè)計(jì)上游引物：5’-GGGGGAGAGAGAGAGAGAGA-3’；下游引物：5’-CAATCTCAAACTTGGCATCCA-3’。反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃30s，53 ℃30s，72 ℃60s，共33 個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，切膠回收后送生工測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)中華獼猴桃F3H基因cDNA 開放閱讀框；利用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)中華獼猴桃F3H理化性質(zhì)；利用ProP 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProP-1.0/）分析中華獼猴桃F3H蛋白信號(hào)肽和前導(dǎo)肽。使用ClustalW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/）進(jìn)行多序列比對(duì)；通過SWISSMODLE（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)中華獼猴桃F3H蛋白三維結(jié)構(gòu)。利用MEGA 6.0 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000 次Bootstraps，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華獼猴桃F3H 蛋白分子特征

中華獼猴桃F3H基因cDNA 序列包含1 364 個(gè)核苷酸，其中包括一個(gè)含有1 101 個(gè)核苷酸的開放閱讀框，可編碼366 個(gè)氨基酸（圖1）。對(duì)中華獼猴桃F3H蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示中華獼猴桃F3H分子質(zhì)量為40.89 kDa，理論等電點(diǎn)為5.40。中華獼猴桃F3H蛋白中不含前導(dǎo)肽和信號(hào)肽（圖2）。

圖1 中華獼猴桃F3H 基因cNDA 及其編碼氨基酸序列

圖2 中華獼猴桃F3H 蛋白信號(hào)肽和前導(dǎo)肽預(yù)測(cè)

2.2 F3H 氨基酸序列對(duì)比

根據(jù)多序列比對(duì)可知，中華獼猴桃F3H蛋白含有5 個(gè)保守基序（圖3）。其中參與Fe2+的結(jié)合是基序4中的His218、Asp220 和基序5 中的His276。基序5 中的Arg286 和Ser288 參與2- 酮戊二酸的結(jié)合，這些保守基序也存在于其他植物F3H氨基酸序列中。而在基序2 和基序3 中，存在3 個(gè)被認(rèn)為在F3H蛋白質(zhì)的折疊過程中起重要作用的嚴(yán)格保守的脯氨酸（Pro148、204、207）。

圖3 中華獼猴桃F3H 與其他植物F3H氨基酸序列對(duì)比

2.3 同源性分析

同源性分析結(jié)果表明，中華獼猴桃F3H氨基酸序列與浙江紅山茶的一致性最高（90.22%），其次與楊梅的一致性為89.89%，與棗的F3H一致性最低（87.98%）。這與多序列比對(duì)的結(jié)果相一致（表1）。

表1 中華獼猴桃F3H 與其他植物一致性分析

2.4 中華獼猴桃F3H 蛋白結(jié)構(gòu)分析

中華獼猴桃F3H蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該蛋白結(jié)構(gòu)以α- 螺旋為主，占41.7%，其次為隨機(jī)卷曲，占36.9%，占比最低的是β- 折疊，為21.4%。獼猴桃F3H蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有His218、Asp220 和His276 三個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)以及兩個(gè)參與2-O- 酮戊二酸合成的結(jié)合位點(diǎn)（Arg286、Ser288）（圖4）。

圖4 中華獼猴桃F3H 蛋白三維結(jié)構(gòu)

2.5 F3H蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，中華獼猴桃F3H氨基酸序列與葡萄F3H氨基酸序列進(jìn)化關(guān)系最為接近，同時(shí)與藤茶、棗、胡桃、川黔千金榆、栗、歐洲栓皮櫟的F3H氨基酸序列聚為一大簇，說明中華獼猴桃F3H在進(jìn)化上的保守性（圖5）。

圖5 中華獼猴桃F3H 與其他植物F3H 的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

3 討 論

隨著植物多酚化學(xué)和藥理學(xué)的不斷發(fā)展，人們慢慢認(rèn)識(shí)到多酚類物質(zhì)是具有獨(dú)特生理活性和藥理活性的天然產(chǎn)物[9]。黃酮類化合物作為一類多酚化合物，是植物中一類重要的有效成分，具有鎮(zhèn)靜、利尿和抗氧化和抗癌等重要作用[10]。F3H基因作為核心類黃酮花青素途徑的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因之一[11]，越來越受到人們的關(guān)注。因此本研究對(duì)中華獼猴桃F3H基因cDNA 進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析。通過對(duì)中華獼猴桃F3H蛋白的預(yù)測(cè)，可知中華獼猴桃F3H蛋白中不含信號(hào)肽和前導(dǎo)肽，與其他植物的F3H蛋白相一致[12-13]。多序列對(duì)比結(jié)果表明，在氨基酸水平上，中華獼猴桃F3H與其他植物的F3H相似性較高，且中華獼猴桃F3H氨基酸中的5 個(gè)保守基序也包含了Fe2+結(jié)合基序和2- 酮戊二酸結(jié)合基序2 個(gè)在大多數(shù)植物F3H都有所涉及的保守基序[12-13]，進(jìn)一步說明了該基因具有較高的保守性。分析系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示中華獼猴桃F3H與葡萄、藤茶、棗等親緣關(guān)系較近，而與荔枝、龍眼等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在一定程度上體現(xiàn)了植物形態(tài)上的分類學(xué)差異，這與紫肉甘薯（Ipomopea batatas）[14]和滇水金鳳（Impatiens uliginosa）[15]結(jié)果一致。本研究為調(diào)節(jié)中華獼猴桃F3H的活性以增加黃酮類化合物含量奠定基礎(chǔ)，為高黃酮中華獼猴桃新品種研發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。