牧亞峰， 左新河， 向 楠， 趙 勇， 華 川2,， 陳繼東2,

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 鄭州 450000；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 武漢 430065；3.湖北省中醫(yī)院， 武漢 430074)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是最常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺疾病，細(xì)胞和抗體介導(dǎo)的慢性免疫性炎癥是甲狀腺組織破壞的主要原因之一[1]。20%～30%患者最終會(huì)發(fā)展為甲狀腺功能減退癥[2]，有研究報(bào)道AIT還是甲狀腺癌的危險(xiǎn)因素[3]。AIT的病因與發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但其發(fā)病是遺傳、環(huán)境、免疫等多因素共同作用的結(jié)果[4]。腸道是人體重要的器官，而腸黏膜屏障作為第一道防線在機(jī)體免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色。目前，已知自身免疫性肝炎、糖尿病、炎癥性腸病、慢性腎臟病等疾病存在腸黏膜屏障損傷，損傷的原因涉及細(xì)胞因子、腸道菌群、腸道免疫功能等多個(gè)方面[5]。然而有關(guān)AIT的腸道研究較少，僅有極少量文獻(xiàn)報(bào)道了腸道菌群與橋本甲狀腺炎的關(guān)系[6]，尚沒(méi)有藥物對(duì)AIT腸道菌群及腸黏膜屏障作用的研究。前期研究表明，芪箭消癭方能夠降低AIT動(dòng)物模型甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibodies，TGAb)、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibodies，TPOAb)水平，減輕甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[7]。本研究采用AIT大鼠模型，以腸道為切入點(diǎn)，探討芪箭消癭方對(duì)AIT大鼠腸道菌群及腸黏膜屏障的影響，為臨床應(yīng)用提供新的思路與參考。本研究通過(guò)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)HUCMS201909008)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量(110±10)g，購(gòu)于三峽大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2017-0012。大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度(55±10)%，光照12 h/d，自由攝食和飲水。

1.2 藥物

芪箭消癭方組成：黃芪30 g，白芍15 g，鬼箭羽15 g，穿山龍15 g。黃芪(1.5 g/袋，相當(dāng)于飲片10 g，批號(hào)19071401)，白芍(1 g/袋，相當(dāng)于飲片10 g，批號(hào)19050921)，鬼箭羽(0.5 g/袋，相當(dāng)于飲片10 g，批號(hào)18041891)，穿山龍(1.67 g/袋，相當(dāng)于飲片10 g，批號(hào)19018041)，江陰天江藥業(yè)有限公司，購(gòu)自湖北省中醫(yī)院中藥配方顆粒藥房。硒酵母片(西維爾，規(guī)格50 μg/片)，牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)H10940161。

1.3 試劑與儀器

豬甲狀腺球蛋白(貨號(hào)180801)、完全弗氏佐劑(貨號(hào)F5881)、不完全弗氏佐劑(貨號(hào)F5506)、碘化鈉(貨號(hào)383112)(美國(guó)Sigma公司)；游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)試劑盒(貨號(hào)0079c)、游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)試劑盒(貨號(hào)0122c)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)試劑盒(貨號(hào)R0009c)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-10試劑盒(貨號(hào)R0016c)及分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulin，sIg)A試劑盒(武漢伊萊瑞特生物公司，貨號(hào)R0875c)；甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibodies，TPOAb)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)E11199r)；甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibodies，TGAb)試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號(hào)R0551)；閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)抗體(Abclonal,貨號(hào)A0659)、閉合蛋白(Occludin)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)13409-1-AP)；β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)BM0627)；DNA提取試劑盒(Omega，貨號(hào)D3450)；DNA聚合酶(TransGen，貨號(hào)AP231-01)；DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，貨號(hào)AP-GX-50)。

離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)H1650-W)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司，型號(hào)Flexstation3)；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，型號(hào)RM2016)；垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠，型號(hào)DYCZ-24DN、DYCZ-40)；生物顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)BX53)；透射電鏡(日本HITACHI公司，型號(hào)HT7700-SS)；分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛公司，型號(hào)NanoDrop2000)；PCR儀(美國(guó)ABI公司，型號(hào)QuantStudio 6)；測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司，型號(hào)Miseq PE300)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

48只雌性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組6組各8只。參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，采用豬甲狀腺球蛋白與弗氏佐劑皮下免疫注射聯(lián)合高碘水喂養(yǎng)制備AIT大鼠模型[8]。依據(jù)人與大鼠等效劑量折算系數(shù)確定給藥劑量，硒酵母組給藥劑量為36 μg/kg(臨床等效劑量)，芪箭消癭方低、中、高劑量組給藥劑量分別為1.8、3.6、7.2 g/kg(分別為臨床等效劑量的1、2、4倍)，對(duì)照組和模型組以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。供試藥液的制備：按組方比例取黃芪、白芍、鬼箭羽、穿山龍配方顆粒，用100 ℃ 0.9%氯化鈉溶液充分溶解，分別制成質(zhì)量濃度為2.4、1.2、0.6 g/mL的溶液；取適量硒酵母片置于研缽中研磨至極細(xì)粉末，加入0.9%氯化鈉溶液充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為3.6 μg/mL的混懸液。以上藥液均分裝并保存于4 ℃冰箱中備用。

2.2 樣本收集與處理

實(shí)驗(yàn)取材前1 d，每組隨機(jī)選取5只大鼠，采用應(yīng)激性排便法收集大鼠糞便樣品，肛周消毒后固定并將大鼠尾部提起，手指按壓下腹部促其排便，收集新鮮糞便2～3顆于滅菌凍存管中，-80 ℃保存；禁食12 h，10%水合氯醛麻醉后暴露胸腔,心臟采血收集于真空采血管，取上清分裝于EP管中，-80 ℃保存；暴露頸部剪下附有甲狀腺的氣管段，冰上分離出甲狀腺，置于4%多聚甲醛中固定；暴露腹腔剪下結(jié)腸，4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗腸腔，擦干后剪取部分結(jié)腸置于4%多聚甲醛及2.5%戊二醛中固定，另將剩余結(jié)腸置于凍存管中，-80 ℃保存。

2.3 HE染色觀察甲狀腺及結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

將經(jīng)4%多聚甲醛固定好的甲狀腺及結(jié)腸組織取出，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)脫蠟、清洗后行HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。參照文獻(xiàn)制定的甲狀腺炎癥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)打分[9]。0分：無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；1分：2個(gè)或3個(gè)甲狀腺濾泡之間的間質(zhì)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；2分：1個(gè)或2個(gè)甲狀腺濾泡大小的浸潤(rùn)灶；3分：廣泛浸潤(rùn)面積達(dá)10%～39%；4分：廣泛浸潤(rùn)面積達(dá)40%～80%；5分：廣泛浸潤(rùn)面積達(dá)80%以上。

2.4 透射電鏡觀察結(jié)腸上皮超微結(jié)構(gòu)

取出2.5%戊二醛固定好的結(jié)腸組織，加入PBS緩沖液反復(fù)沖洗，1%鋨酸室溫固定2 h，梯度酒精脫水，將丙酮與環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑按1∶1混合滲透過(guò)夜、包埋，70 nm超薄切片，鈾鉛雙染色。透射電鏡下觀察結(jié)腸組織緊密連接、上皮微絨毛等超微結(jié)構(gòu)。

2.5 ELISA檢測(cè)血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-10及結(jié)腸sIgA的含量

血清自然解凍，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-10含量。取結(jié)腸組織稱(chēng)重并剪碎，將其與PBS緩沖液(按1∶9的重量體積比)加入組織研磨器中，充分冰浴研磨得勻漿液，取上清液，同法檢測(cè)結(jié)腸sIgA含量。

2.6 Western blot檢測(cè)結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白

向剪碎的結(jié)腸組織中加入磷酸酶抑制劑裂解，勻漿后取上清，BCA測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣后經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳并分離轉(zhuǎn)膜，TBST封閉2 h后加入稀釋的一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入稀釋的二抗(1∶50000)，37 ℃孵育2 h，ECL顯影曝光，掃描膠片，BandScan軟件分析條帶灰度值。

2.7 糞便菌群DNA提取及測(cè)序

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組大鼠糞便樣品進(jìn)行DNA抽提。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，NanoDrop2000測(cè)定DNA濃度和純度。使用擴(kuò)增引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3’)對(duì)16 S rRNA V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠回收，利用DNA凝膠試劑盒對(duì)回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)，利用MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。最后，基于生物信息云平臺(tái)對(duì)OTUs進(jìn)行不同水平(門(mén)、屬)物種注釋。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，對(duì)糞便菌群進(jìn)行物種多樣性(α多樣性、β多樣性)及物種分類(lèi)學(xué)組成分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 甲狀腺組織HE染色結(jié)果

圖1示，炎癥評(píng)分結(jié)果顯示，對(duì)照組為0分，模型組評(píng)分較其明顯增高(P<0.01)，與模型組比較，各藥物組評(píng)分顯著降低(P<0.01)。甲狀腺HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，呈類(lèi)圓形或多邊形，濾泡上皮細(xì)胞呈單層立方形，排列整齊，濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)，濾泡間隙未見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組濾泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，大部分濾泡結(jié)構(gòu)破壞萎縮，可見(jiàn)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；硒酵母組濾泡上皮細(xì)胞排列尚整齊，濾泡腔萎縮，膠質(zhì)含量減少，可見(jiàn)吸收空泡；芪箭消癭方各劑量組濾泡結(jié)構(gòu)完整性改善，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，病變程度減輕。

3.2 結(jié)腸組織HE染色及超微病理變化

圖2示，結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組結(jié)腸黏膜完整，上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜隱窩平行排列，杯狀細(xì)胞豐富，無(wú)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；與對(duì)照組比較，模型組結(jié)腸黏膜上皮部分?jǐn)嗔亚也煌暾?，黏膜隱窩形態(tài)扭曲，伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，芪箭消癭方低劑量組、芪箭消癭方中劑量組、芪箭消癭方高劑量組及硒酵母組結(jié)腸黏膜完整性有所恢復(fù)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

注:C.對(duì)照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組;與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01;箭頭指淋巴細(xì)胞聚集圖1 各組大鼠甲狀腺組織HE染色及炎癥評(píng)分結(jié)果比較(×100)

注:C.對(duì)照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組圖2 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果比較(×100)

圖3示，結(jié)腸黏膜超微病理顯示，對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)完整，連接致密、連續(xù)，橋粒密度較高，上皮細(xì)胞表面微絨毛正常。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞間緊密連接出現(xiàn)部分?jǐn)嗔?，連接開(kāi)放、疏松，橋粒密度下降，微絨毛數(shù)量減少且排列較紊亂。經(jīng)芪箭消癭方低、中、高劑量及硒酵母干預(yù)后，細(xì)胞間緊密連接連續(xù)性均有不同程度恢復(fù)，連接更加緊密，腸上皮微絨毛數(shù)量增加，排列較模型組整齊。

注:C.對(duì)照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組(“*”所指為橋粒,“→”指緊密連接斷裂處)圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜超微病理結(jié)果比較(鈾鉛雙染色×12000)

3.3 血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-10結(jié)果

表1示，與對(duì)照組比較，模型組FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ水平顯著升高(P<0.01)，IL-10水平明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組FT3、FT4、TGAb、TPOAb、IFN-γ水平明顯下降(P<0.05,P<0.01)，IL-10水平明顯上升(P<0.01)。

表1 各組大鼠血清ELISA檢測(cè)結(jié)果

3.4 結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白及sIgA表達(dá)結(jié)果

圖4A、4B、4C示，與對(duì)照組比較，模型組ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。圖4D示，與對(duì)照組比較，模型組sIgA水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組sIgA水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。

注:C.對(duì)照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組；閉鎖連接蛋白(zonula occludens，ZO)-1,閉合蛋白(Occludin)，分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulin，sIg)A；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01圖4 各組大鼠結(jié)腸ZO-1、Occludin蛋白及sIgA表達(dá)比較

3.5 腸道菌群的變化

3.5.1 物種多樣性分析 本研究共得到2020932條有效序列。表2示，各組Shannon、Simpson、chao、ace指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖5A示，當(dāng)OTUs水平逐漸增加時(shí)曲線趨于直線，大部分樣本所含OTUs在400～600之間，表明腸道微生物豐富度較高且分布較均勻。圖5B示，當(dāng)Shannon指數(shù)達(dá)到3.7時(shí)，各樣本稀釋曲線趨向平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)足夠大，能夠反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。圖5C韋恩圖顯示，6組共有728個(gè)重疊的OTUs，對(duì)照組、模型組、硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組分別獨(dú)有18、13、16、10、7、8個(gè)OTUs。圖5 D PCoA圖示，對(duì)照組和模型組在PC1水平上呈明顯分開(kāi)，表明AIT大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)較對(duì)照組有改變且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而給藥后硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組在PC1水平上偏離模型組的距離逐漸增大，說(shuō)明給藥后大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

表2 各組大鼠α多樣性指數(shù)結(jié)果比較

3.5.2 門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)組成分析 在門(mén)水平(Phylum)上，各組大鼠腸道菌群包括厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、柔膜菌門(mén)(Tenericutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)等主要門(mén)類(lèi)。對(duì)照組大鼠腸道菌群中厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。與對(duì)照組比較，模型組厚壁菌門(mén)比例明顯升高(P<0.01)，擬桿菌門(mén)下降(P<0.01)，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比值(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)上升(P<0.01)。與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組厚壁菌門(mén)比例顯著下降(P<0.05)，擬桿菌門(mén)比例上升(P<0.05)，F(xiàn)/B值降低(P<0.01)(見(jiàn)表3圖6A)。

注：A.Rank-Abundance曲線；B.稀釋曲線；C.韋恩圖；D.PCoA圖；C.對(duì)照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組。圖5 OTUs曲線及β多樣性分析比較

3.5.3 屬水平群落結(jié)構(gòu)組成分析 在屬水平(Genus)上，各組大鼠腸道菌群主要包括Muribaculaceae、瘤胃球菌屬Ruminococcaceae、毛螺菌屬Lachnospiraceae、乳酸桿菌屬Lactobacillus、擬桿菌屬Bacteroides、克里斯滕森菌屬Christensenellaceae、普雷沃氏菌屬Prevotellaceae、羅姆布茨菌Romboutsia等，其中乳酸桿菌屬與普雷沃氏菌屬組間變化顯著。與對(duì)照組比較，模型組乳酸桿菌屬和普雷沃氏菌屬豐度明顯下降(P<0.01)。與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方低、中劑量組乳酸桿菌屬豐度呈不同程度回升(P<0.05)，高劑量組乳酸桿菌屬豐度呈下降趨勢(shì)(P>0.05)；而在普雷沃氏菌豐度水平方面，與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組呈下降趨勢(shì)(P>0.05)，芪箭消癭方低劑量組成上升趨勢(shì)(P>0.05)(見(jiàn)表3圖6B)。

表3 各組大鼠門(mén)水平與屬水平腸道菌群變化比較

4 討論

AIT是典型的進(jìn)行性自身免疫性疾病，近年來(lái)發(fā)病率日趨升高。由于發(fā)病機(jī)制不明，臨床表現(xiàn)不典型，部分患者在未診斷時(shí)可能已發(fā)展為甲狀腺功能減退癥。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段多為激素、硒制劑或隨訪觀察，尚不能完全根治。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)甲狀腺抗體水平的同時(shí)，還能降低西藥毒副作用以及兼顧乏力、便秘等臨床癥狀，具有顯著的療效優(yōu)勢(shì)。AIT屬于中醫(yī)學(xué)“癭病”范疇，多由正氣不足、痰濁瘀血結(jié)于頸前所致。臨床辨證以此證為主者，當(dāng)以益氣扶正、化痰活血法治療。芪箭消癭方正是以“扶正祛邪”為大法，重用甘溫之黃芪以益氣扶正，白芍柔肝斂陰，佐以鬼箭羽活血通絡(luò)，穿山龍活血之余兼能化痰，全方共達(dá)益氣養(yǎng)陰、化痰活血之功。本研究大鼠造模后甲狀腺抗體水平升高，甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)破壞且炎癥評(píng)分增高，表明成功誘導(dǎo)出AIT動(dòng)物模型。硒酵母廣泛應(yīng)用于AIT的臨床治療，加之其良好的藥物安全性及有效性，故將硒酵母作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。

注:C.對(duì)照組;M.模型組;Se.硒酵母組;LQ.芪箭消癭方低劑量組;MQ.芪箭消癭方中劑量組;HQ.芪箭消癭方高劑量組圖6 門(mén)水平(A)與屬水平(B)腸道菌群變化比較

腸道菌群與人類(lèi)共存，研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病、炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病與腸道菌群存在關(guān)聯(lián)[10]。厚壁菌及擬桿菌是哺乳動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)菌群[11]，而F/B與某些病理狀態(tài)相關(guān)，是腸道菌群健康的重要指標(biāo)[12]。本研究顯示，AIT大鼠腸道厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度變化，F(xiàn)/B上升，表明AIT大鼠腸道菌門(mén)物種比例失調(diào)，菌群呈紊亂態(tài)勢(shì)。該研究結(jié)果與Ishaq[13]所報(bào)道的一致。經(jīng)芪箭消癭方干預(yù)后，F(xiàn)/B下調(diào)，菌門(mén)物種比例失調(diào)得以糾正。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AIT大鼠腸道乳酸桿菌及普雷沃氏菌相對(duì)豐度下降，這與AIT患者腸道菌群分析的結(jié)果相同[14]。乳酸桿菌是益生菌的重要來(lái)源，能夠通過(guò)分泌乳酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)降低腸道pH，具有殺菌或抑制病原菌黏附感染的作用[15]。研究表明，乳酸桿菌參與調(diào)節(jié)sIgA的分泌[16]。普雷沃氏菌具有定殖性和低致病性，在哮喘、慢性阻塞性肺疾病中明顯減少[17]，能夠利用富含纖維的碳水化合物生產(chǎn)短鏈脂肪酸，發(fā)揮抗炎作用[18]。低、中劑量芪箭消癭方給藥后，乳酸桿菌相對(duì)豐度上升，而高劑量組反應(yīng)不敏感。低劑量組普雷沃氏菌相對(duì)豐度有回升趨勢(shì)，而中、高劑量組則呈下降趨勢(shì)，這可能與方劑中藥物成分濃度增加、抑菌作用藥物成分占主導(dǎo)地位有關(guān)。腸道菌群具有多種功能，可影響其生長(zhǎng)和定殖能力，同時(shí)能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生下游效應(yīng)，這種效應(yīng)可能有益亦可能有害[19]。某些腸道菌群能夠生產(chǎn)機(jī)體所沒(méi)有的特定酶，將碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)酵成短鏈脂肪酸[20，21]。短鏈脂肪酸具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，同時(shí)還能夠維持腸上皮完整性、生產(chǎn)維生素、免疫系統(tǒng)信號(hào)分子與細(xì)胞交互以及激活和抑制特異性反應(yīng)[22]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可有效維持腸道上皮的再生和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而修復(fù)病理?yè)p傷后的腸黏膜[23]。然而部分腸道菌群可突破腸黏膜屏障與免疫系統(tǒng)接觸，進(jìn)而引起炎癥[24]。

腸黏膜屏障是抵抗有害病原體的第一道防線[25]，緊密連接是維持腸黏膜機(jī)械屏障功能完整的重要結(jié)構(gòu)[26]。緊密連接蛋白主要包括以O(shè)ccludin為代表的跨膜蛋白和以ZO-1為代表的胞漿蛋白，前者胞間兩兩相連形成吻合結(jié)構(gòu)而封閉細(xì)胞間隙，后者與前者相互連接，使緊密連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而更加穩(wěn)定[27]。sIgA是腸黏膜免疫屏障的重要組成部分，與體液及細(xì)胞免疫共同發(fā)揮局部免疫功能[28]，具有增強(qiáng)腸道免疫、阻止條件致病菌增殖及病原菌入侵、恢復(fù)腸道微生態(tài)平衡的作用[29]。IL-10在炎癥過(guò)程中可引起多種宿主防御機(jī)制，尤其是上皮細(xì)胞的防御機(jī)制，其本身具有抑制炎癥反應(yīng)并限制炎癥所導(dǎo)致的組織破壞作用[30]。本研究結(jié)果顯示，AIT大鼠結(jié)腸sIgA、ZO-1蛋白、Occludin蛋白表達(dá)明顯下降，結(jié)腸黏膜上皮部分損傷伴緊密連接完整性受損，腸黏膜屏障功能失常并伴有損傷。經(jīng)芪箭消癭方干預(yù)后，sIgA、ZO-1蛋白、Occludin蛋白表達(dá)上調(diào)，結(jié)腸黏膜病理形態(tài)及緊密連接結(jié)構(gòu)有不同程度恢復(fù)，說(shuō)明腸黏膜屏障功能損傷得到修復(fù)。同時(shí)，腸道菌群的組成受到黏膜免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，細(xì)胞間緊密連接功能強(qiáng)弱又可通過(guò)影響腸黏膜通透性決定菌群抗原是否暴露，腸道菌群、緊密連接、腸黏膜免疫屏障之間的相互協(xié)調(diào)作用有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)[31]。

綜上所述，芪箭消癭方能夠降低AIT大鼠甲狀腺功能、甲狀腺抗體及炎癥因子水平，改善甲狀腺組織炎癥浸潤(rùn)及炎癥評(píng)分，減輕結(jié)腸黏膜病理?yè)p傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群生物多樣性及物種組成有關(guān)，進(jìn)而增加結(jié)腸緊密連接蛋白及sIgA表達(dá)，改善腸黏膜屏障損傷而起到治療作用。