黃 虹黃 蝶王瑞杰余壯明

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院介入血管外科,?？?570102;2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液透析科,海口 570102;3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科,?？?570102;4.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科,?？?570102)

結(jié)腸癌作為消化道常見腫瘤,在中國(guó)其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌,位于第3,早期癥狀不明顯,與腸炎等良性疾病易混淆,發(fā)現(xiàn)時(shí)已至晚期,且發(fā)病趨于年輕化,危害嚴(yán)重[1]。 目前治療結(jié)腸癌常見藥物為奧沙利鉑,但該藥物對(duì)血液、神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生毒性,不能長(zhǎng)期使用[2],因此,尋找安全有效且毒性副作用均低的藥物對(duì)于治療尤為重要。 辣椒素在臨床上應(yīng)用有數(shù)十年,是辣椒中具有辛辣刺激性的復(fù)合物,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗肥胖、保護(hù)心臟等多項(xiàng)作用,且對(duì)腫瘤的作用越來越受到重視[3]。辣椒素作為潛在的新型治療藥物在人類癌癥中有一定應(yīng)用,具有抗增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬、抗血管生成和抗轉(zhuǎn)移等作用[4]。 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子1(metastasis suppressor1,MTSS1)作為細(xì)胞間連接,參與肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞核形成與細(xì)胞間微絲分支穩(wěn)定性,可降低腫瘤的遷移、浸潤(rùn)能力[5]。 在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可以上調(diào)MTSS1、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases, MMP)-2、MMP-9,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的抑制[6],但在結(jié)腸癌中尚無發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。 因此, 本文以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 作為研究對(duì)象,探討辣椒素對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的影響,并初步探討其機(jī)制,為臨床上辣椒素對(duì)結(jié)腸癌的治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 購自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫,目錄號(hào):TCHu99。

1.2 主要試劑與儀器

辣椒素購自美國(guó)Sigma 公司,貨號(hào):M1022-50M;引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成;LipofectamineTM2000 購自美國(guó)invitrogen 公司,貨號(hào):11668019;CCK8 試劑盒購自廣州佳研生物科技有限公司,貨號(hào):MA0218-15;結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天公司,貨號(hào):C0121;一抗辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)、MTSS1、MMP-2、MMP-9 購自英國(guó)abcam 公司,貨號(hào)分別為:ab6166、ab204127、ab92536、ab228402。 Transwell 小 室 購 自Costar 公司,型號(hào):3460;全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國(guó)Bio-Rad 公司,型號(hào):Model 680;蛋白凝膠成像儀購自上海Tanon 公司,型號(hào):Tanon2500。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中,37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng),2 ～3 d 更換1 次培養(yǎng)液,細(xì)胞密度長(zhǎng)至90%時(shí)傳代,細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 siRNA 引物設(shè)計(jì)

Whitehead siRNA Selection Web Server 在線設(shè)計(jì),MTSS1 siRNA:5’-GGTTCTGATTACAGCTGGT-3’、對(duì)照siRNA:5’-UACAGACCCCUCGAUCGGUTT-3’。

1.3.3 細(xì)胞分組

HCT116 細(xì)胞參考文獻(xiàn)[7]處理并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1:10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組(10、25、50、100 μmol/L capsaicin group)分別加入終濃度為10、25、50、100 μmol/L 辣椒素,對(duì)照組(control group)不添加辣椒素,37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)2:對(duì)照組(control group)、100 μmol/L 辣椒素組(100 μmol/L capsaicin group)、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組(100 μmol/L capsaicin+control siRNA group)、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組(100 μmol/L capsaicin+MTSS1 siRNA group),100 μmol/L

辣椒素組添加終濃度為100 μmol/L 辣椒素;100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組在100 μmol/L 辣椒素組的基礎(chǔ)上分別添加終濃度為50 nmol/L 對(duì)照siRNA、MTSS1 siRNA(參照LipofectamineTM2000 說明書轉(zhuǎn)染),轉(zhuǎn)染4 h 更換為終濃度為100 μmol/L 辣椒素培養(yǎng)液,對(duì)照組正常培養(yǎng)24 h。 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平。

1.3.4 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

各組細(xì)胞在96 孔板中處理24 h,加入CCK8 繼續(xù)培養(yǎng)2 h,全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)下各孔吸光度(optical density,OD),增殖抑制率=(對(duì)照孔OD450-實(shí)驗(yàn)孔OD450)/對(duì)照組OD450×100%,6 個(gè)重復(fù)孔。

1.3.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況

各組細(xì)胞在24 孔板中處理24 h,收集細(xì)胞,無胎牛血清培養(yǎng)液稀釋成每毫升1×104個(gè)的單細(xì)胞懸液,Transwell 小室經(jīng)基質(zhì)膠上下包被后放入24 孔板中,小室下層加500 μL 完全培養(yǎng)液,上層加500 μL單細(xì)胞懸液,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,結(jié)晶紫染色后顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況

各組細(xì)胞在6 孔板中處理24 h,去培養(yǎng)液,PBS清洗細(xì)胞,劃痕后立即拍照,添加10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h 拍照,Image J 檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。 遷移百分比=(0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積)/0 h 劃痕面積×100%。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)情況

各組細(xì)胞在6 孔板中處理24 h,添加蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min,10000 r/min 4℃離心20 min,上清為總蛋白,BCA 蛋白試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。 每孔上樣20 μg,聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠、分離膠分離蛋白,NC 膜轉(zhuǎn)膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加對(duì)應(yīng)一抗TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9,4℃孵育過夜,洗滌后添加對(duì)應(yīng)二抗常溫下孵育2 h。DAB 顯色試劑盒顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn),P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 辣椒素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比,25、50、100 μmol/L 辣椒素組細(xì)胞增殖抑制率升高(P＜0.05)。 見表1。

2.2 辣椒素對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組細(xì)胞侵襲數(shù)量降低(P＜0.05)。 見表1、圖1。

圖1 不同濃度辣椒素處理細(xì)胞侵襲情況Figure 1 Invasion of cells at different concentrations of capsaicin concentrations of capsaicin

表1 不同濃度辣椒素處理細(xì)胞增殖抑制率、侵襲數(shù)量、遷移百分比的比較(n=6)Table 1 Comparison of cell proliferation inhibition rate, invasion number, and migration percentage at different

2.3 辣椒素對(duì)細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組細(xì)胞遷移百分比降低(P＜0.05)。 見表1、圖2。

圖2 不同濃度辣椒素處理細(xì)胞遷移情況Figure 2 Migration of cells at different concentrations of capsaicin

2.4 辣椒素對(duì)細(xì)胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比,10、25、50、100 μmol/L 辣椒素組細(xì)胞中TRPV1、MTSS1 蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低(P＜0.05)。 見表2、圖3。

圖3 不同濃度辣椒素處理細(xì)胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平情況Figure 3 Protein levels of TRPV1, MTSS1, MMP-2 and MMP-9 in cells with different concentrations of capsaicin

表2 不同濃度辣椒素處理細(xì)胞中TRPV1、MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比較(n=6)Table 2 Comparison of TRPV1, MTSS1, MMP-2 and MMP-9 protein levels in cells with different concentrations of capsaicin

2.5 干擾MTSS1 對(duì)辣椒素處理細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組相比,100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細(xì)胞侵襲數(shù)量降低(P＜0.05);分別與100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA組細(xì)胞侵襲數(shù)量升高(P＜0.05)。 見圖4、表3。

圖4 干擾MTSS1 后辣椒素處理細(xì)胞侵襲的情況Figure 4 Invasion of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

2.6 干擾MTSS1 對(duì)辣椒素處理細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比,100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細(xì)胞遷移百分比降低(P＜0.05);分別與100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA組相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細(xì)胞遷移百分比升高(P＜0.05)。 見圖5、表3。

表3 干擾MTSS1 后辣椒素處理細(xì)胞侵襲數(shù)量、遷移百分比的比較(n=6)Table 3 Comparison of the invasion and migration of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

圖5 干擾MTSS1 后辣椒素處理細(xì)胞遷移情況Figure 5 Migration of capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

2.7 干擾MTSS1 對(duì)辣椒素處理細(xì)胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比,100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組、100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA 組細(xì)胞中MTSS1 蛋白水平升高,MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低(P＜0.05);分別與100 μmol/L 辣椒素組、100 μmol/L 辣椒素+對(duì)照siRNA 組相比,100 μmol/L 辣椒素+MTSS1 siRNA組細(xì)胞中MTSS1 蛋白水平降低,MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高(P＜0.05)。 見表4、圖6。

表4 干擾MTSS1 后辣椒素處理細(xì)胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比較(n=6)Table 4 Comparison of MTSS1, MMP-2 and MMP-9 protein levels in capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

圖6 干擾MTSS1 后辣椒素處理細(xì)胞中MTSS1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平情況Figure 6 Protein levels of MTSS1, MMP-2 and MMP-9 in capsaicin-treated cells by interference with MTSS1

3 討論

結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移會(huì)造成遠(yuǎn)處肺、骨、肝轉(zhuǎn)移,侵襲、轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的最主要原因[8],因此,發(fā)現(xiàn)一種可以有效抑制結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移且副作用小物質(zhì)對(duì)于結(jié)腸癌的治療意義重大。 辣椒素作為辣椒皮質(zhì)中生物堿,通過TRPV1 或其他途徑參與抗腫瘤作用,是抗腫瘤潛在藥物,具有廣闊應(yīng)用前景[9-10],但作用機(jī)制復(fù)雜,目前具體機(jī)制尚不清楚,尚需進(jìn)一步研究。 研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移,提示辣椒素對(duì)結(jié)腸癌具有抑制侵襲、遷移作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌的保護(hù),但尚需研究機(jī)制。

辣椒素是唯一一種TRPV1 的天然激活劑,在結(jié)直腸的黏膜層、黏膜下層、肌肉層、肌肉神經(jīng)叢中均發(fā)現(xiàn)TRPV1 的表達(dá),可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、分泌、循環(huán)等功能[11-12];在結(jié)腸癌中表達(dá)水平低于遠(yuǎn)處正常組織,可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[13]。 研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌細(xì)胞中添加辣椒素可以增加TRPV1 的蛋白水平,提示辣椒素激活TRPV1,實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌的影響。 MTSS1 作為細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白銜接蛋白,作為支架蛋白參與板狀偽足形成過程,發(fā)揮腫瘤抑制作用[14],在正常組織中均有表達(dá),但在結(jié)直腸癌、結(jié)腸癌中低表達(dá)甚至不表達(dá),被認(rèn)為是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制型基因[15-16]。 MMPs 幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中各種蛋白成分,可破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[17];在眾多MMPs 中,MMP-2、MMP-9 參與血管基底膜降解過程,與腫瘤侵襲、遷移關(guān)系密切[18-19]。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)MTSS1 可以降低MMP-2、MMP-9 的表達(dá),在膠質(zhì)瘤中MTSS1 調(diào)控MMP-2、MMP-9 發(fā)揮作用[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),添加辣椒素后可以促進(jìn)MTSS1 的表達(dá),從而降低MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá),抑制結(jié)腸癌侵襲、遷移過程。 而添加MTSS1 抑制劑后,細(xì)胞侵襲、遷移過程增強(qiáng),細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)升高;MTSS1 抑制劑可以減弱辣椒素對(duì)細(xì)胞侵襲、遷移的抑制過程。 提示辣椒素通過促進(jìn)MTSS1 表達(dá),抑制MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)侵襲、遷移的抑制。

綜上所述,辣椒素通過上調(diào)MTSS1 表達(dá)從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移過程,實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌的保護(hù),為臨床上結(jié)腸癌的治療提供一定參考依據(jù)。 但辣椒素不同濃度對(duì)腫瘤的影響差異極大,研究辣椒素治療結(jié)腸癌的最佳濃度是后續(xù)探究重點(diǎn)。