沈欽海張盟輝秦召敏*劉 軍

(1.山東醫(yī)學高等?？茖W校醫(yī)學系,濟南 250002;2.山東省濟南市第四人民醫(yī)院普通外科,山東大學附屬省立醫(yī)院,濟南 250000;3.山東大學齊魯醫(yī)院,濟南 250021)

肝缺血再灌注損傷常見于出血性休克、肝手術、肝移植術等過程中,可引起肝損傷、肝衰竭等,也是肝手術移植失敗的重要原因[1]。 自噬是一個將自身細胞器或細胞質(zhì)中的蛋白包被形成囊泡,通過自噬溶酶體,使囊泡內(nèi)容物降解的過程,在機體生理和病理過程中常見[2],其發(fā)揮的作用在不同組織和細胞中各不相同。 前人研究發(fā)現(xiàn),在肝缺血再灌注損傷過程中,上調(diào)細胞自噬具有保護肝功能的作用[3]。 另外,通過提高腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路調(diào)節(jié)的自噬,可緩解缺血再灌注誘導的肝損傷[4]。 槲皮素是一種天然的膳食黃酮,具有顯著的抗氧化作用,可通過降低炎癥反應,對心臟等器官起保護作用[5]。 而且槲皮素能有效改善大鼠肝缺血再灌注損傷[6],但是槲皮素預處理對大鼠肝缺血再灌注損傷的緩解作用及對AMPK/mTOR 信號通路介導自噬途徑的影響,未見報道。 本研究使用槲皮素及自噬抑制劑氯喹預處理肝缺血再灌注損傷的大鼠模型,旨在從AMPK/mTOR 信號通路探討槲皮素對缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠(50 只,雄性,5 周齡,體重170～180 g)購自山東大學醫(yī)學院實驗中心[SCXK(魯)2018-0003],于山東大學實驗室飼養(yǎng)[SYXK(魯)2019-0043],符合山東大學實驗室動物倫理保護標準及相關法律規(guī)定(2020-S-09),按照3R 原則關照實驗動物。

1.2 主要試劑與儀器

槲皮素(原料藥,純度≥98%)購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;自噬抑制物-氯喹(規(guī)格:50 mg,純度:97%),購自麥克林生化科技有限公司。

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海雅吉生物 科 技 有 限 公 司; 單 丹 磺 酰 尸 胺(monodansylcadaverin,MDC)購自上?；鶢栴D生物科技有限公司; β-actin 鼠抗購自Sigma 公司;Beclin1、磷酸化(phosphorylation,p)-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR 一抗和辣根過氧化物酶標記的IgG二抗均購自Abcam 公司。

全自動生化分析儀(BK-200 型)購自山東博科;酶標儀(Fax-20100 型)購自美國INStat;光學顯微鏡(SMZ745 型)購自日本尼康;ChemiDoc-MP 全能型凝膠成像分析系統(tǒng)購自山東三瑞科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝缺血再灌注大鼠模型的建立及分組

將SPF 級SD 大鼠使用隨機數(shù)字表法分為對照組,模型組、槲皮素組、氯喹組和槲皮素+氯喹組。手術前3 天,槲皮素組大鼠灌胃給予槲皮素(0.5%羧甲基纖維素鈉溶解),給藥劑量0.1 g/kg[7],氯喹組大鼠腹腔注射0.02 g/kg 氯喹[8](自噬抑制劑,蒸餾水溶解),槲皮素+氯喹組灌胃給予槲皮素同時腹腔注射氯喹,對照組和模型組給予等體積蒸餾水和0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑,每天1 次。 參考馬志勇等[9]方法構(gòu)建肝缺血再灌注大鼠模型:大鼠術前禁食12 h,自由飲水,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,固定于手術板上,切開腹壁,游離肝蒂,使用血管夾鉗夾肝蒂進行肝缺血,60 min 后松開血管夾使血液灌注6 h,其中對照組僅游離肝蒂不進行嵌夾,所有大鼠血液再灌注6 h 后處死,收集各組大鼠血液、肝組織進行檢測。

1.3.2 全自動生化分析儀檢測大鼠肝功能指標

分離上述1.3.1 中收集的各組大鼠部分新鮮血液中血清(剩余血清置于4℃冰箱中,用于后續(xù)檢測),置于全動生化分析儀上檢測血清中谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸?；D(zhuǎn)移酶(AST)水平。 兩者用于反映肝功能的指標,水平越高表明肝損傷越嚴重。

1.3.3 HE 染色觀察各組大鼠肝組織病理學變化

取上述1.3.1 中收集的各組大鼠部分新鮮肝組織,經(jīng)過固定(4%多聚甲醛,24 h)、包埋(石蠟)、切片(5 μm),然后脫蠟(二甲苯)、脫水(梯度乙醇)、染色(蘇木精-伊紅)等過程,具體操作步驟嚴格按照HE 染色試劑盒進行,最后在石蠟切片中滴1 滴中性樹膠進行封片,光學顯微鏡觀察。

1.3.4 ELISA 法檢測血清中炎性因子含量

取上述1.3.1 中置于4℃冰箱中的各組大鼠剩余血清,嚴格按照IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 MDC 觀察并計算各組肝組織細胞中自噬率

取上述1.3.1 中收集的各組大鼠新鮮肝組織各0.05 g 剪碎、胰蛋白酶制成單細胞懸液(剩余肝組織置于-80℃冰箱中保存),接種至6 孔板(2 mL/孔),將6 孔板離心、PBS 緩沖液洗滌、1 mL 4%多聚甲醛固定、50 μmol/L MDC 染色、37℃溫育,30 min 后,觀察并計數(shù)MDC 陽性細胞,MDC 陽性細胞率即為細胞自噬率。

1.3.6 Western blot 法檢測各組大鼠肝組織中Beclin1、AMPK、mTOR 蛋白表達水平

取上述1.3.5 中置于-80℃冰箱中的大鼠肝組織,提取總蛋白并對蛋白進行定量,然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,與Beclin1、AMPK、p-AMPK、p-mTOR、mTOR、β-actin鼠抗(稀釋比均為1 ∶2000)4℃孵育過夜,與辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG 二抗(1 ∶5000)室溫孵育2 h 后、顯色、凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用軟件SPSS 24.0 進行統(tǒng)計分析,平均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示計量數(shù)據(jù),多組間比較和進一步兩兩間比較分別行單因素方差分析和SNK-q檢驗,P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素預處理對肝缺血再灌注大鼠肝功能指標的影響

模型組ALT 和AST 水平顯著高于對照組(P＜0.05);槲皮素組ALT 和AST 水平顯著低于模型組(P＜0.05),氯喹組ALT 和AST 水平顯著高于模型組(P＜0.05)。 與槲皮素組相比,槲皮素+氯喹組ALT 和AST 水平顯著升高(P＜0.05);與氯喹組相比,槲皮素+氯喹組ALT 和AST 水平顯著降低(P＜0.05)。 見表1。

表1 各組大鼠肝功能指標比較(ˉx±s,n=10)Table 1 Liver function indexes of rats in each group

2.2 槲皮素預處理對肝缺血再灌注大鼠肝組織病理學變化的影響

對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝細胞排列整齊,無顯著壞死現(xiàn)象;模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞排列疏松,出現(xiàn)壞死,槲皮素組較模型組大鼠肝組織病理損傷有所緩解,氯喹組較模型組大鼠肝組織病理損傷加重;槲皮素+氯喹組較槲皮素組大鼠肝組織病理損傷加重,較氯喹組大黃素肝組織病理損傷減輕。 見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學HE 染色圖Figure 1 Hepatic histopathological HE staining of rats in each group

2.3 槲皮素預處理對肝缺血再灌注大鼠血清中炎性因子含量的影響

模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著高于對照組(P＜0.05);與模型組相比,槲皮素組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著降低(P＜0.05),氯喹組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著升高(P＜0.05)。 與槲皮素組相比,槲皮素+氯喹組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著升高(P＜0.05);與氯喹組相比,槲皮素+氯喹組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β 含量比較(ˉx±s,n=10)Table 2 Contents of IL-6, TNF-α and IL-1β in serum of rats in each group

2.4 槲皮素預處理對肝缺血再灌注大鼠肝組織細胞自噬率的影響

與對照組相比,模型組大鼠肝組織細胞自噬率顯著降低(P＜0.05);與模型組相比,槲皮素組大鼠肝組織細胞自噬率顯著升高(P＜0.05),氯喹組大鼠肝組織細胞自噬率顯著降低(P＜0.05)。 與槲皮素組相比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織細胞自噬率顯著降低(P＜0.05);與氯喹組相比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織細胞自噬率顯著升高(P＜0.05)。 見表3、圖2。

注:箭頭所示為MDC 染色陽性細胞。

表3 各組大鼠肝組織細胞自噬率比較(ˉx±s,n=10)Table 3 Autophagy rates in liver tissue cells of rats in each group

2.5 槲皮素預處理對肝缺血再灌注大鼠肝組織Beclin1、AMPK、mTOR 蛋白表達水平的影響

模型組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著低于對照組(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著高于對照組(P＜0.05)。槲皮素組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著高于模型組(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著低于模型組(P＜0.05);氯喹組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著低于模型組(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著高于模型組。 與槲皮素組比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著降低(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著升高(P＜0.05);與氯喹組比,槲皮素+氯喹組大鼠肝組織中Beclin1蛋白表達水平及AMPK 蛋白磷酸化水平顯著升高(P＜0.05),mTOR 蛋白磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。 見表4、圖3。

表4 各組大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達及AMPK 和mTOR 蛋白磷酸化水平比較(ˉx±s,n=10)Table 4 Comparison of Beclin1 protein and AMPK,mTOR phosphorylation proteins expression levels in liver tissue of rats in each group

圖3 各組大鼠肝組織中Beclin1、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR 蛋白表達條帶圖Figure 3 Expression of Beclin1, p-AMPK, AMPK,p-mTOR and mTOR proteins in liver tissue of rats in each group

3 討論

肝缺血再灌注是肝手術或肝移植的必要組成部分,缺血過程中不可避免會造成肝細胞損傷,再灌注后肝功能也不太可能迅速恢復正常[10]。 在大多數(shù)情況下,術后會出現(xiàn)肝炎癥、損傷甚至嚴重的肝功能障礙,嚴重者甚至可導致多器官功能衰竭甚至死亡[11]。 因此,預防和減輕肝缺血再灌注損傷對改善患者預后、降低死亡率具有重要影響。 何瑩等[12]研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠肝缺血再灌注損傷伴隨自噬作用降低及自噬相關蛋白水平顯著下降。 本研究通過構(gòu)建大鼠肝缺血再灌注損傷,發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞排列疏松,出現(xiàn)壞死,ALT 和AST 水平、IL-6、TNF-α、IL-1β 含量顯著升高,肝組織細胞自噬率、Beclin1 蛋白表達水平顯著降低,提示肝缺血再灌注大鼠肝組織出現(xiàn)病理損傷及炎癥反應,且細胞自噬減少。

槲皮素可以降低血壓、血脂,抗癌、抗炎和抗氧化應激,對多種心血管疾病具有良好的治療效果,廣泛存在于雙子植物中,是一種黃酮類化合物[13]。其中,槲皮素不但能顯著抑制乳腺癌細胞的生長[14],還能誘發(fā)原發(fā)積液性淋巴瘤細胞的自噬[15]。另外,Uylas 等[16]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素在正確劑量下可有效預防肝缺血再灌注損傷,He 等[17]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過mTOR 途徑增強缺氧誘導的肺動脈平滑肌細胞自噬,治療缺氧相關性肺動脈高壓疾病。 本研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可顯著緩解肝缺血再灌注大鼠肝組織病理損傷,降低肝功能指標ALT 和AST水平以及炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β 含量,提高肝組織細胞自噬率和Beclin1 蛋白表達水平,提示槲皮素能夠激活細胞自噬,緩解肝損傷。 但其中的機制尚需進一步研究。

Wang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)高血糖通過抑制AMPK/mTOR 介導的自噬,促進肝內(nèi)巨噬細胞NLRP3 炎癥小體的激活,加重急性肝損傷。 本研究發(fā)現(xiàn),肝缺血再灌注模型大鼠肝組織中Beclin1 蛋白表達水平、AMPK 蛋白磷酸化水平顯著降低,mTOR 蛋白磷酸化水平顯著升高,提示AMPK/mTOR 信號通路介導的自噬在模型大鼠中處于抑制狀態(tài),而經(jīng)槲皮素預處理后,AMPK/mTOR 信號通路介導的自噬得到激活。 另外,腎上腺髓質(zhì)素可能通過AMPK/mTOR 軸激活自噬,從而保護間質(zhì)細胞的甾體生成功能,防止細胞焦亡[19];阻礙AMPK/mTOR 信號通路介導的自噬能夠促進小鼠非酒精性脂肪肝[20]。 為進一步探究槲皮素是通過AMPK/mTOR 信號通路介導的自噬發(fā)揮肝缺血再灌注損傷的保護作用,本研究通過采用自噬抑制劑氯喹單獨及槲皮素和氯喹聯(lián)合預處理肝缺血再灌注大鼠,發(fā)現(xiàn)大鼠肝組織病理損傷程度介于槲皮素和氯喹單獨干預之間;ALT 和AST 水平、IL-6、TNF-α、IL-1β 含量以及mTOR 蛋白磷酸化水平比槲皮素單獨干預升高,比氯喹單獨干預降低,肝組織細胞自噬率、Beclin1 蛋白表達水平及AMPK 蛋白磷酸化水平比槲皮素單獨干預降低,比氯喹單獨干預升高,提示槲皮素改善肝缺血再灌注大鼠肝損傷的作用可被氯喹逆轉(zhuǎn),進一步說明槲皮素減輕肝缺血再灌注大鼠肝損傷的作用機制與激活AMPK/mTOR 信號通路介導的自噬有關。

綜上所述,槲皮素預處理可能通過激活肝缺血再灌注大鼠肝組織中AMPK/mTOR 信號通路介導的自噬,緩解肝損傷。 但是自噬涉及的信號通路較多且肝缺血再灌注的作用機制較為復雜,槲皮素預處理對肝缺血再灌注大鼠的保護作用,是否還涉及自噬相關的其他信號通路,尚需進一步研究。