周曉英 宗兆文 鮑全偉

1.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系高原生理學(xué)與病理學(xué)教研室，重慶 400038 2.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍衛(wèi)勤基地戰(zhàn)救技能培訓(xùn)教研室，重慶 400038 3.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，重慶 400037

骨量下降、骨骼退行性變、并發(fā)骨折導(dǎo)致老年人死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[1-2]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與體內(nèi)多種細(xì)胞生理的調(diào)節(jié)，在成骨細(xì)胞的成熟、分化，骨質(zhì)量調(diào)節(jié)，關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均起到不可替代作用[3-5]。研究顯示眾多抗骨質(zhì)疏松藥物調(diào)節(jié)骨量直接或間接通過(guò)該信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，針對(duì)該信號(hào)通路的藥物用于骨質(zhì)疏松的治療也取得了一定療效。但目前尚未有報(bào)道激活該信號(hào)通路后老年小鼠與成年小鼠骨量增加的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)擬將在成年與老年小鼠中激活該通路并對(duì)骨量增加的作用進(jìn)行對(duì)比探討。

1 材料和方法

1.1 基因小鼠的激活

選取4月齡與18月齡基因型為3.2Cre；Catnb+/lox(exon3)小鼠各6只作為成年組與老年組，并選取相應(yīng)年齡段同窩WT小鼠各6只作為對(duì)照組。注射他莫昔芬，激活小鼠成骨細(xì)胞內(nèi)β-catenin。藥物注射方式：腹腔注射；濃度為：TM75 mg/kg；頻次：2次/周；注射時(shí)長(zhǎng)：4周[6-8]。激活小鼠表示以CA-β-catenin命名。

1.2 CT圖像采集

采用小動(dòng)物CT成像系統(tǒng)對(duì)小鼠脛骨標(biāo)本進(jìn)行掃描，并分別計(jì)算骨體積(BV，mm3)占組織總體積(TV，mm3)的百分比(BV/TV，%)，骨小梁數(shù)目(Tb.N)，骨小梁分離度(Tb.Sp)，骨小粱厚度(Tb.Th)[9]。

1.3 HE染色

將標(biāo)本制作4 μm石蠟組織切片。染色具體方法為：①脫蠟；②切片上滴加蘇木精染液，約50 μL，染色時(shí)間為2 min；③滴加伊紅染色液，約50 μL，1 min。

1.4 免疫組化染色

染色具體流程為：①消除過(guò)氧化物酶：滴加專(zhuān)用復(fù)合液，每個(gè)標(biāo)本約為50 μL，時(shí)間不小于5 min；②抗原修復(fù)：清洗后滴加抗原修復(fù)液，每個(gè)標(biāo)本約為50 μL，時(shí)間不少于30 min；③血清封閉：清洗后滴加血清封閉液，每個(gè)標(biāo)本約為50 μL，時(shí)間20 min，不洗；④每個(gè)標(biāo)本滴加TNAP一抗，平均每個(gè)標(biāo)本約50 μL，然后于濕盒內(nèi)反應(yīng)，4 ℃時(shí)間大于16個(gè)小時(shí)；⑤將濕盒拿出置于37 ℃孵箱內(nèi)復(fù)溫，時(shí)間不少于60 min；⑥滴加相對(duì)應(yīng)的二抗，每個(gè)標(biāo)本約50 μL，37 ℃，1 h；⑦SABC液，37 ℃，30 min，PBS清洗；⑧顯微鏡下顯色觀察。

1.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

染色步驟：①萘酚AS-BI磷酸鹽溶液100 μL，37 ℃、45 min；②基礎(chǔ)孵育液添加5 %副品紅及4 %亞硝酸鈉，孵育2～3 min；③封片觀察[8]。

1.6 小鼠血清學(xué)生化檢測(cè)

收集小鼠血清，血清采集方法為：①摘除小鼠眼球，擠壓小鼠腹部用1.5 mL EP管收集小鼠血液；②將收集樣本靜置；③等待樣本凝固后離心機(jī)上1 500 r/min，10 min；④另取EP管，將離心后的上清收集備用。運(yùn)用小鼠骨特堿性磷酸酶ELISA試劑盒以及小鼠Ⅰ型膠原N端肽ELISA試劑盒檢測(cè)骨形成及骨吸收指標(biāo)的血清含量[8]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 成年與老年組中CA-β-catenin小鼠相比于野生小鼠骨量均增多

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各年齡段中CA-β-catenin小鼠的骨量均多于同組的野生型小鼠(圖1)。HE染色結(jié)果，提示成年與老年組中CA-β-catenin小鼠脛骨干骺端骨髓腔內(nèi)骨小梁均較野生型增加(圖1a～d)；將小鼠脛骨干骺端行CT二維掃描，并計(jì)算骨量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論成年還是老年組中CA-β-catenin小鼠干骺端骨小梁數(shù)目(Tb.N)，骨組織體積比(BV/TV，%)，骨小粱厚度(Tb.Th)均較WT小鼠增多(P<0.01)，以上結(jié)果均提示持續(xù)激活β連環(huán)蛋白后小鼠骨量會(huì)增加。骨量的多少通常由成骨與破骨的平衡所決定，非組織特異性的堿性磷酸酶(non-tissue specific alkaline phosphatase，TNAP)，可用來(lái)反映成骨細(xì)胞活性，針對(duì)TNAP免疫組化染色結(jié)果提示各年齡段中CA-β-catenin小鼠TNAP陽(yáng)性成骨細(xì)胞數(shù)量均多于同窩WT 小鼠(圖2a～d,i)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)結(jié)果提示各年齡段中CA-β-catenin小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量均少于同窩WT 小鼠(圖2e～h,j)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示各年齡段中CA-β-catenin小鼠骨形成指標(biāo)ALP均高于同窩WT 小鼠(圖2k)，而骨吸收指標(biāo)CTCX1均低于同窩WT 小鼠(圖2 l)。

注：a～d：各組小鼠HE染色結(jié)果；e～h：各組小鼠CT掃描二維圖片；i～l：CT數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。** P<0.01，放大倍數(shù)：40×。圖1 各組小鼠骨量變化Fig.1 Changes of bone mass in mice in each group

2.2 不同年齡組中CA-β-catenin小鼠骨量增加有差異

雖然在成年組和老年組持續(xù)激活β-catenin后其骨量都比WT小鼠有增加，但老年CA-β-catenin小鼠與成年CA-β-catenin小鼠相比，骨量增加特點(diǎn)卻不盡相同。持續(xù)激活β-catenin后，成年CA-β-catenin小鼠總骨量明顯多于老年CA-β-catenin小鼠(圖3a～c)，但將成年及老年組CA-β-catenin小鼠小鼠注射激活β-catenin藥物前后對(duì)照可發(fā)現(xiàn)老年組CA-β-catenin小鼠骨量增加幅度ΔTb.Th、ΔBV/TV、ΔTb.N比成年組更大(圖3 d～h)，分析破骨細(xì)胞染色結(jié)果可發(fā)現(xiàn)老年組CA-β-catenin小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量多于成年組CA-β-catenin小鼠(圖3i)。

注：a～c：成年與老年組中CA-β-catenin小鼠骨量對(duì)比；d～g：成年與老年組中CA-β-catenin小鼠激活β-catenin前后骨量變化對(duì)比；i：成年與老年組中CA-β-catenin小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量對(duì)比。*P<0.05。圖3 CA-β-catenin小鼠骨量變化分析Fig.3 Analysis of bone mass changes in CA-β-catenin mice

3 討論

近年來(lái)，骨質(zhì)疏松有年輕化趨勢(shì)，各個(gè)年齡階段均有可能罹患骨質(zhì)疏松，整體形式嚴(yán)峻。目前針對(duì)骨質(zhì)疏松的藥物治療方案有抗骨吸收及促進(jìn)骨形成。然而對(duì)不同年齡段骨質(zhì)疏松治療方案選擇尚缺乏有力基礎(chǔ)研究支持。本研究比較了成年與老年小鼠中激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路后對(duì)骨量變化的影響。

Wnt/β-catenin被證實(shí)與骨發(fā)育及骨量相關(guān)[6-8]，當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin作為信號(hào)分子可進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)如：ALP、OSX等[10-11]。以往的研究證實(shí)3.2kbCol 1 Cre表達(dá)于成骨細(xì)胞內(nèi)，可特異性敲出錨定的基因[6-7]。在本研究中，運(yùn)用3.2Cre；Catnb+/lox(exon3)小鼠可于成骨細(xì)胞中特異性激活β-catenin。

本研究發(fā)現(xiàn)激活β-catenin后成年及老年小鼠TNAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均上升，血清中ALP活性均上升。Wnt/β-catenin信號(hào)通路除了可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生理活動(dòng)，還可以通過(guò)成骨細(xì)胞分泌OPN調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)激活β-catenin后成年及老年小鼠TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯下降，血清中CTCX1活性明顯下降，這些骨形成指標(biāo)上升、骨吸收指標(biāo)下降，共同導(dǎo)致激活β-catenin后小鼠骨量增加。雖然持續(xù)激活β-catenin使小鼠骨量增加，但也發(fā)現(xiàn)在持續(xù)激活β-catenin前后各組小鼠自身骨量變化對(duì)比發(fā)現(xiàn)老年組CA-β-catenin小鼠骨量變化幅度較成年CA-β-catenin小鼠大。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)老年組CA-β-catenin小鼠總骨量低于成年CA-β-catenin小鼠，這可能與老年組CA-β-catenin小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量多于成年組CA-β-catenin小鼠有關(guān)，因年齡導(dǎo)致老年組CA-β-catenin小鼠破骨細(xì)胞活性強(qiáng)于成年組CA-β-catenin小鼠，導(dǎo)致骨吸收強(qiáng)于成年組CA-β-catenin小鼠。以上研究提示在老年性骨質(zhì)疏松治療時(shí)需同時(shí)促進(jìn)骨形成與抑制骨吸收才能達(dá)到最佳效果。

現(xiàn)臨床治療骨質(zhì)疏松主要是運(yùn)用抗骨吸收藥物，該類(lèi)藥物只能抑制骨不繼續(xù)吸收，無(wú)法促進(jìn)新骨形成。現(xiàn)有通過(guò)批準(zhǔn)的骨合成代謝藥物只有重組甲狀旁腺激素(rPTH，特立帕肽)，然而這種藥物因?yàn)檠娱L(zhǎng)治療時(shí)間可能會(huì)增加罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，因此在使用2年后必須停用，這限制了其長(zhǎng)期運(yùn)用[15]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)藥物可同時(shí)促進(jìn)骨形成及抑制骨吸收，貌似給了我們一條不錯(cuò)的前景，但通過(guò)我們研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于老年小鼠增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)后成骨細(xì)胞及骨形成指標(biāo)上升，破骨細(xì)胞及骨吸收指標(biāo)下降，但相較于成年小鼠其破骨細(xì)胞數(shù)量及骨吸收指標(biāo)仍然較高，這對(duì)于臨床治療有著重要指導(dǎo)意義。

通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)老年性骨質(zhì)疏松運(yùn)用Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)藥物可以取得較好效果，但仍需關(guān)注老年自身高骨吸收。