王永樂，韓靜靜，王云婷，李宛蓉

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000）

0 引言

新型冠狀病毒肺炎自2019 年12 月爆發(fā)以來，確診病例數(shù)仍在不斷增加，新型冠狀病毒肺炎已波及國內(nèi)多個省市及全球多個國家和地區(qū)。通過積極防控和救治，我國境內(nèi)疫情基本得到控制，僅在個別地區(qū)出現(xiàn)局部暴發(fā)和少數(shù)境外輸入病例。由于全球疫情仍在蔓延，且可能較長時期存在，新冠肺炎在我國傳播和擴散的風險也將持續(xù)存在[1]。

由于開發(fā)周期長，且病毒變異很快的特點，疫苗不能作為抵抗新冠肺炎的唯一途徑。新冠肺炎病情與個體體質(zhì)、病毒變異密切相關，表現(xiàn)錯綜復雜，病情演變與轉(zhuǎn)歸不一。中醫(yī)藥早期干預、辨證論治、整體調(diào)節(jié)對新冠肺炎療效確切[2]。通過辨證論治，多以提高人體免疫力及部分抗病毒、抗炎的中藥相互配伍使用，中藥復方在抗疫初期至目前都是對新冠肺炎的預防和輔助治療的重要方法之一[3-7]。

七味湯是由湖北省中醫(yī)院多位專家根據(jù)患者臨床癥候辨證論治、借鑒SARS 中醫(yī)防治經(jīng)驗研制出的藥方，該藥方在新型冠狀肺炎的預防上有顯著效果并得到廣泛應用，這將是預防新型冠狀肺炎有效藥方之一。七味湯由黃芪15 g，炒白術9 g，防風9 g，貫眾6 g，銀花9 g，陳皮6 g，佩蘭9 g 組成，臨床用來預防和治療新冠肺炎，具有清熱解毒、燥濕化濁、增強免疫力之功效。但是，該藥方需要通過現(xiàn)場熬制才能服用，耗費大量時間，也加大了疫情防控的工作量，加之有些普通民眾并不了解中藥熬制的方法，因此將七味湯開發(fā)為現(xiàn)代制劑尤為重要。采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化七味湯的最佳提取工藝。

1 儀器與材料

1.1 主要材料

黃芪，岷縣和泰中藥材有限公司提供；金銀花，河南省新封金銀花開發(fā)有限公司提供；炒白術，岷縣和泰中藥材有限公司提供；陳皮、佩蘭、貫眾、防風，河北康安生物科技有限公司提供；其他試劑均為藥用試劑。

1.2 主要試驗儀器

V-5600 型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；YRE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責任公司產(chǎn)品；AL104 型分析天平，梅特勒-托利多股份有限公司產(chǎn)品；HH-ZK4 型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，鞏義市英峪高科儀器廠產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 吸水率的測定

根據(jù)處方稱取，記質(zhì)量A，加入10 倍量水浸泡過夜后稱取藥材總質(zhì)量記為B，根據(jù)吸水率計算公式計算得吸水率。如此重復3 次試驗。

吸水率計算公式：

2.2 提取液的含量測定

2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

先配制出0.1 mg/mL 的葡萄糖標液100 mL，然后稱取蒽酮50 mg 加蒸餾水25 mL，再加入質(zhì)量分數(shù)為98%的濃硫酸75 mL 配制蒽酮硫酸溶液[8]。顯色劑用量的考查：在0.1 mL 葡萄糖標液中加蒸餾水至1 mL，分別加入不同量的顯色劑，測定吸光度。顯色時間的考查：在0.1 mL 葡萄糖標液中加蒸餾水至1 mL，加入蒽酮硫酸溶液9 mL 后，分別沸水浴3，6，9，11 min，冷卻，測定吸光度。繪制葡萄糖標準曲線：改變葡萄糖標液和蒸餾水的用量，再分別加入顯色劑9 mL，沸水浴9 min，于波長625 nm處測定吸光度[9]。

2.2.2 多糖含量的測定

取稀釋后的七味湯提取液1 mL，加入9 mL 蒽酮-硫酸溶液，沸水浴9 min，冷卻后測吸光度，從標準曲線上查看對應的多糖質(zhì)量濃度[9]，并依據(jù)多糖提取率公式計算多糖提取率。

多糖提取率公式：

式中：Y——七味湯多糖提取率，%；

C——七味湯中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——七味湯稀釋液體積，mL；

N——七味湯提取液稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗對多糖提取率的影響

以復方中總多糖含量為評價指標，單因素試驗分別篩選復方提取時煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量。

（1） 煎煮時間對提取率的影響。選取煎煮時間分別為0.5，1.5，3.0 h，浸泡時間12 h，10 倍用水量，煎煮2 次后濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

（2） 煎煮次數(shù)對提取率的影響。選取煎煮次數(shù)分別為1，2，3 次，10 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1.5 h 后濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

（3） 加水量對提取率的影響。分別加5，10，15 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1 h，煎煮2 次后濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

2.4 正交試驗優(yōu)選提取工藝

藥材的主要有效成分多為有機酸、皂苷及多糖類成分，均有較好的水溶性，且該方臨床以湯劑形式應用，為充分保證其原有的臨床療效與物質(zhì)基礎，試驗采用水煎煮法進行提取。根據(jù)單因素試驗結果，以復方中總多糖含量為評價指標，采用正交試驗法對用水量（A）、煎煮時間（B） 和煎煮次數(shù)（C） 進行三因素三水平的正交試驗[10-11]。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

3 試驗結果

3.1 吸水率測定

根據(jù)吸水率計算公式算出吸水率。重復3 次試驗后稱量藥材吸水前后總質(zhì)量得試驗結果平均吸水率為327%。

3.2 多糖含量的測定

（1） 吸收曲線。用紫外-可見分光光度計于波長500~700 nm 處進行光譜掃描，結果發(fā)現(xiàn)在波長625 nm 處有最大吸收，故試驗采用625 nm 為測定波長。

（2） 顯色劑用量。顯色劑用量與吸光度的關系（見圖1），當顯色劑用量為9 mL 時吸光度最大，故試驗采用顯色劑用量為9 mL。

（3） 顯色時間。吸光度與顯色時間關系（見圖2），沸水浴時間在9 min 內(nèi)，隨著時間的增加吸光度值顯著增大，9 min 后吸光度值減小，12 min 后吸光度值大致保持不變，因而最佳顯色時間為9 min。

（4） 標準曲線。葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的關系（見圖3），得出吸光度（Y） 與葡萄糖質(zhì)量濃度（X） 的回歸方程為Y=0.0401X+0.002 2，R2=0.998 3，在質(zhì)量濃度0~10 mg/mL 內(nèi)線性關系良好。

顯色劑用量與吸光度關系曲線見圖1，顯色時間與吸光度關系曲線見圖2，葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度關系見圖3。

圖1 顯色劑用量與吸光度關系曲線

圖2 顯色時間與吸光度關系曲線

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度關系

3.3 單因素試驗和正交試驗篩選最優(yōu)提取工藝

3.3.1 煎煮時間對多糖提取率的影響

選取煎煮時間分別為0.5，1.0，1.5 h，浸泡時間12 h，8 倍用水量，煎煮2 次后，濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

煎煮時間與多糖提取率的關系見圖4。

圖4 煎煮時間與多糖提取率的關系

3.3.2 煎煮次數(shù)對多糖提取率的影響

選取煎煮次數(shù)分別為1，2，3 次，8 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1 h 后定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

煎煮次數(shù)與多糖提取率的關系見圖5。

圖5 煎煮次數(shù)與多糖提取率的關系

3.3.3 加水量對多糖提取率的影響

分別加6，8，10 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1 h煎煮2 次后定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

加水量與多糖提取率的關系見圖6。

圖6 加水量與多糖提取率的關系

3.4 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以多糖含量為指標，對煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量進行三因素三水平的正交試驗。

正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結果

由表2 可知，用水劑量1，2，3 分別代表用水量為6，8，10 倍；煎煮時間1，2，3 分別代表煎煮時間為0.5，1.0，1.5 h；煎煮次數(shù)1，2，3 分別代表煎煮次數(shù)為1，2，3 次；影響因素主次關系由大到小是煎煮次數(shù)、用水劑量和煎煮時間。

由表3 可知，加水量（A） 因素F0.05(2,2)＜F＜F(2,2)0.01，即0.01＜p＜0.05，差異顯著。

表3 方差分析

煎煮時間（B） 因素F＜0.05(2,2)，即p＞0.05，差異不顯著。煎煮次數(shù)（C） 因素F＞0.01(2,2)，即p＜0.01，差異極顯著。

通過正交試驗結果可知，七味湯提取工藝的最佳水平為A3B3C3，即用水量為10 倍，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為3 次。

4 結論

以多糖提取率作為指標，采用單因素試驗與正交試驗法對優(yōu)化七味湯最佳提取工藝。結果表明，七味湯提取工藝的最佳提取工藝為用水量為10 倍，煎煮時間1.5 h，煎煮次數(shù)3 次。

七味中藥材中都含有的有效物質(zhì)是多糖，因此將多糖提取率作為測定標準，通過單因素試驗與正交因素相結合得出最佳提取方案。優(yōu)化了七味湯的最佳提取工藝，將七味湯制成現(xiàn)代顆粒藥劑奠定基礎。后續(xù)將對七味湯的抑菌作用進行研究，并將七味湯開發(fā)為七味顆粒劑，希望可以作為病毒性肺炎及細菌性肺炎的輔助用藥。