劉玲玲,李冰寧,楊夢奇,楊明,武彥文*

1(北京市科學(xué)技術(shù)研究院 分析測試研究所(北京市理化分析測試中心),北京,100094)2(北京市食品安全測試工程技術(shù)研究中心,北京,100094)

自從2008年歐洲進口的烏克蘭葵花籽油被礦物油污染的事件發(fā)生之后[1],歐盟對各類食品中的礦物油污染情況一直非常重視,先后出臺了“食品中礦物油的科學(xué)意見”[2]、國際標準ISO 17780—2015《動植物油脂 植物油中脂肪烴的測定》和歐盟標準EN 16995—2017《植物油和植物油基食品中飽和烴和芳香烴礦物油的測定》以及相關(guān)監(jiān)管規(guī)范[3]。根據(jù)歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)的規(guī)定,礦物油是石油和合成油及其精煉產(chǎn)品,包含n-C10～n-C50碳氫化合物,可分為飽和烴礦物油(mineral oil saturated hydrocarbons,MOSH)和芳香烴礦物油(mineral oil aromatic hydrocarbons,MOAH)2類[2]。礦物油可以通過原料、生產(chǎn)、包裝、運輸整個產(chǎn)業(yè)鏈遷移污染食品[2,4-5],因而歐盟呼吁世界各國廣泛收集礦物油污染數(shù)據(jù)[6]。然而,目前的調(diào)查尚不充分[7-8],我國的調(diào)查更少;并且現(xiàn)有數(shù)據(jù)主要集中于食用油、巧克力、奶粉、大米、餅干、面包等[7,9-15],對飲料酒的關(guān)注很少。CASTLE等[16]采用GC測定啤酒中的礦物油,以考察包裝材料的遷移情況,結(jié)果因方法的定量限過高(0.1 mg/kg)而未檢出[16];JICKELLS等[17]采用GC分析了105個葡萄酒樣品,目的是考察瓶塞涂抹礦物油蠟的遷移情況,結(jié)果也因方法的定量限太高(0.2 mg/L)而未檢出。

由于礦物油能溶于乙醇,因而高酒精度(乙醇體積分數(shù))酒可能會有礦物油污染。我國的白酒酒精度(30%～70%)遠高于文獻報道的啤酒(1%～8%)和葡萄酒(7%～18%)[18-19],因此有必要了解白酒的礦物油污染情況。本文采用高效液相色譜-氣相色譜聯(lián)用(HPLC-GC)技術(shù),通過GC分離柱之前的保留間隙柱、三通和溶劑揮發(fā)出口,實現(xiàn)大體積進樣,將常規(guī)GC的分析靈敏度提高了100多倍[20-21]。

基于上述分析,本文首先優(yōu)化了不同酒精度飲料酒的提取方法,然后通過HPLC-GC建立了白酒、葡萄酒和啤酒中的MOSH和MOAH的高靈敏測定方法,最后應(yīng)用該方法調(diào)查了部分市售飲料酒產(chǎn)品的礦物油含量,并且分析了礦物油與酒精度、包裝材料的關(guān)聯(lián)性,以探究其污染來源。

1 材料與方法

1.1 樣品

收集了北京市場上的17個飲料酒,其中白酒9個(A1～A9)、葡萄酒(B1～B4)和啤酒(C1～C4)各4個,樣品的酒精度和包裝信息見表1。

1.2 試劑與標準品

正己烷、二氯甲烷和無水乙醇均為色譜純試劑,美國Fisher Scientific公司;無水硫酸鈉(分析純),國藥集團化學(xué)試劑有限公司;2種混合標準溶液：含有9種化合物的MOSH/MOAH混合標準溶液,北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司,其中正十一烷(n-undecane,n-C11)、環(huán)己基環(huán)己烷(bicyclohexyl,Cycy)、戊基苯(amylbenzene,5B)、1-甲基萘(1-methylnaphthalene,1-MN)、2-甲基萘(2-methylnaphthalene,2-MN)、1,3,5-三叔丁基苯(1,3,5-tri-tert-butylbenzene,TBB)的質(zhì)量濃度均為300 mg/L,正十三烷(n-tridecane,n-C13)的質(zhì)量濃度為150 mg/L,膽甾烷(5-alpha-cholestane,Cho)和苝(perylene,Per)的質(zhì)量濃度為600 mg/L。自行配制碳數(shù)保留時間混合標準溶液,其中正構(gòu)烷烴標準品購自美國Restek公司,溶液中含有n-C10、n-C11、n-C13、n-C16、n-C20、n-C24、n-C25、n-C35、n-C40、n-C50各100 mg/L,用于劃分碳數(shù)范圍。

1.3 儀器與設(shè)備

HPLC-GC聯(lián)用儀器由3部分組成：LC 20AD液相色譜儀(配備紫外檢測器)、2010 plus氣相色譜儀(配備FID檢測器),日本島津公司;HPLC-GC接口,德國Axel Semrau公司。R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士步琦有限公司;HeraeusMegafuge 8離心機,美國Fisher Scientific公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 提取與濃縮

取20 mL白酒置于玻璃離心管中,加入10 μL的MOSH/MOAH混合標準溶液,加入10 mL正己烷振蕩1 h,然后加入10 mL去離子水,離心取上清液,以無水硫酸鈉除去水分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 mL,供HPLC-GC分析。

取20 mL啤酒和葡萄酒樣品(啤酒和起泡葡萄酒超聲脫氣10 min)置于玻璃離心管中,加入10 μL的MOSH/MOAH混合標準溶液,加入20 mLV(正己烷)∶V(乙醇)=1∶1混合試劑振蕩1 h,離心取上清液,以無水硫酸鈉除去水分,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 mL,供HPLC-GC分析。

1.4.2 HPLC-GC分析

1.4.2.1 HPLC條件

采用Restek Allure Si(250 mm×2.1 mm,5 μm)色譜柱。流動相A為正己烷,流動相B為二氯甲烷,采用梯度洗脫程序：0～0.1 min,100% A(流速為0.3 mL/min);0.1～6.2 min,70%A(流速為0.3 mL/min);6.2～15.2 min,100% B(反沖,流速為0.5 mL/min);15.2～25.2 min,100% A(流速為0.5 mL/min);25.2～30 min,100% A(流速為0.3 mL/min)。進樣量為100 μL。采用紫外分光光度計(230 nm)監(jiān)測HPLC的流動相與MOAH流出情況。

1.4.2.2 HPLC-GC接口

經(jīng)HPLC分離得到MOSH(2.0～3.5 min)和MOAH(4.5～6.0 min)2段流分,通過閥切換導(dǎo)入GC,以保留間隙與溶劑揮發(fā)出口完成大體積進樣。

1.4.2.3 GC條件

GC儀器配置兩套完全相同的通道,每個通道均采用Restek MXT(10 m×0.53 mm)無涂層毛細管預(yù)柱和Restek MXT-1(15 m×0.25 mm×0.25 μm)分析柱,保留間隙柱與分析柱之間通過三通與溶劑排出閥連接;程序升溫為初始溫度60 ℃,保持6 min,以15 ℃/min升溫至120 ℃,再以25 ℃/min升溫至370 ℃,保持6 min;氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)溫度為380 ℃;載氣為氫氣(純度≥99.995%),MOSH和MOAH通道的初始壓力分別為80和79 kPa;輔助氣、燃燒氣和助燃氣分別為氮氣、氫氣和空氣,流速分別為30、40、400 mL/min。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

MOSH和MOAH的GC譜圖呈跨越一定沸程范圍的駝峰,定量計算時,MOSH/MOAH的含量通過積分計算基線與駝峰之間的面積得到,基線由空白實驗獲得;駝峰上方的尖峰需要扣除[20-21]。內(nèi)標法定量：MOSH的內(nèi)標物為Cycy,MOAH的內(nèi)標物為2-MN。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取

2.1.1 提取溶劑

基于相似相溶原理,以弱極性溶劑提取礦物油。通常,為了匹配HPLC-GC分析,常用正己烷作提取溶劑[20]。因此,飲料酒中的礦物油提取是一個液液萃取過程。由表1可知,白酒的酒精度最高,含量在40%～68%;其次是葡萄酒,酒精度為11%～14.5%;啤酒的乙醇體積分數(shù)僅為3.3%～5%。因此,飲料酒中的礦物油的提取方法實際上就是根據(jù)樣品中的乙醇含量,匹配出最優(yōu)的正己烷-乙醇-水溶劑體系,以達到最好的礦物油提取效果。

由于白酒的酒精度中位值為52%,因而可以粗略認為其V(乙醇)∶V(水)=1∶1,即20 mL白酒中乙醇和水均為10 mL。通常,為了達到最佳萃取效果,水-乙醇-正己烷溶劑體系體積比應(yīng)接近2∶1∶1[20]。因此,提取白酒中的礦物油需要添加10 mL正己烷和10 mL水。同樣地,葡萄酒和啤酒中的乙醇含量較低,可以粗略認為由水組成,可在20 mL 2種發(fā)酵酒中添加10 mL正己烷和10 mL乙醇進行提取。

2.1.2 提取級數(shù)

以樣品A1為例,分別比較了提取1次和2次的分析結(jié)果(表2)。結(jié)果表明,2次提取的MOSH含量僅比提取1次的增加了2.7%,說明1次即可將絕大部分礦物油提取出來?？紤]到提取2次消耗的時間和溶劑均增加1倍,因此確定提取級數(shù)為1次。

表2 提取次數(shù)對同一樣品中MOSH(n-C10～C50)測定的影響(n=3)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 定量限

HPLC-GC的檢測器為FID,利用FID對不同碳氫化合物的等碳響應(yīng)原理,即同樣質(zhì)量烴類物質(zhì)的FID響應(yīng)值近似,因而可以通過內(nèi)標法對不同來源的礦物油進行準確定量,也就解決了礦物油缺乏標準參考物質(zhì)的難題[20]。不過,礦物油涉及的碳數(shù)范圍較廣(n-C10～C50),化合物眾多,無法分離,其GC-FID譜圖是數(shù)以萬計化合物組成的駝峰。該駝峰必須距離基線一定高度才能準確積分計算,從而滿足分析檢測的不確定度要求。因此,一般儀器噪音計算檢出限的方法GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》不適用于本方法。通常,礦物油的分析方法定量限(limit of quantification,LOQ)通過經(jīng)驗值計算[20]。

歐盟委員會聯(lián)合研究中心(European Commission’s Joint Research Centre,JRC)2019年出臺的指導(dǎo)意見《食品和食品接觸材料中礦物油測試的取樣、分析和數(shù)據(jù)報告指南》中指出：礦物油的LOQ值除了受基線影響,駝峰寬度(碳數(shù)范圍)的影響也較大[3]。因此,至少需要有50～100 ng礦物油進入FID才能準確定量。飲料酒的LOQ值計算方法是：取樣量為20 mL,經(jīng)提取、濃縮后得到體積為1 mL,注入HPLC-GC的體積為100 μL,相當(dāng)于2 mL樣品中的礦物油進入FID檢測,因而對應(yīng)的LOQ值為0.05 mg/L(以進入檢測器的礦物油質(zhì)量為100 ng計算)。如果需要更低的LOQ值,則需要增加取樣量或濃縮倍數(shù)。

2.2.2 回收率和精密度

本實驗選取白酒樣品進行基質(zhì)加標回收率實驗,MOSH的添加量為2個水平,分別為0.05和0.50 mg/L;考慮到MOAH的含量較低,添加量為1個水平,含量為0.05 mg/L,平行測定6次后計算加標回收率和RSD。結(jié)果顯示：加標回收率為87%～107%,RSD為1.9%～4.9%(表3),說明該方法的準確度滿足分析檢測要求。

表3 加標回收率考察(n=6)Table 3 Recoveries of spiked samples(n=6)

2.3 樣品分析

應(yīng)用建立的分析方法分別測定了17個市售白酒、葡萄酒和啤酒中的MOSH和MOAH的含量,并且根據(jù)JRC指南要求劃分了碳數(shù)范圍(碳段),其中MOSH劃分為6個碳段,MOAH劃分為4個碳段。結(jié)果表明(表4),盡管本文的方法定量限比文獻值低[16-17],但沒有在啤酒和葡萄酒中檢出礦物油,卻在5個白酒中檢出MOSH,其中2個含有MOAH。礦物油的檢出率超過了50%,說明白酒的礦物油污染嚴重,應(yīng)當(dāng)予以重視。

由于白酒比葡萄酒和啤酒更容易受到礦物油污染,結(jié)合3種飲料酒的酒精度,很容易得出乙醇含量與礦物油相關(guān)的結(jié)論。原因可能與礦物油在乙醇和水中的溶解性相關(guān),通常,礦物油更容易溶解于乙醇中。這一點和礦物油與脂肪的相關(guān)性類似,通常脂肪含量越高,受礦物油污染的風(fēng)險越大,因此,食用油一直是礦物油污染的“重災(zāi)區(qū)”[12,15]。

表4 白酒中的礦物油含量 單位：mg/L

表4中的A1和A2來自同一廠家的2個包裝相同的產(chǎn)品,它們的MOSH含量分別為0.37 mg/L和0.17 mg/L;比較HPLC-GC譜圖發(fā)現(xiàn),2個樣品的駝峰形狀相似,碳數(shù)范圍均為n-C12～C22,且均以n-C16為中心(圖1),說明同一廠家的污染來源相同。由于A1和A2的酒精度分別為56%和46%,對應(yīng)MOSH含量分別為0.37和0.17 mg/L,進一步說明酒精度與礦物油呈正相關(guān)。

圖1 白酒樣品A1和A2的HPLC-GC譜圖Fig.1 HPLC-GC chromatograms of MOSH in Baijiu samples

然而,其他白酒樣品的礦物油與乙醇并非完全相關(guān),如酒精度為52%的樣品A4和A7并沒有檢出礦物油,反而酒精度只有43%的A5檢出含有MOSH(0.06 mg/L)。說明礦物油污染來源主要與生產(chǎn)廠家相關(guān),規(guī)范的生產(chǎn)工藝可以有效避免礦物油污染。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)2個白酒樣品(A8和A9)含有MOAH,它們的HPLC-GC譜圖中MOSH和MOAH的峰形和碳數(shù)范圍高度對應(yīng)(圖2),這是礦物油污染的典型特征[20]。但是,A8和A9之間的峰形和碳數(shù)范圍有差異,說明污染來源不同。

a-白酒樣品A8;b-白酒樣品A9圖2 白酒樣品A8和A9中MOSH和MOAH的HPLC-GC譜圖Fig.2 HPLC-GC chromatograms of MOSH and MOAH in Baijiu samples

A8和A9來自不同生產(chǎn)廠家,A8為米香型白酒,其MOSH由2個駝峰組成,第1個峰的碳數(shù)以n-C17為中心,范圍為n-C12～C20,含量為0.10 mg/L;第2個峰以n-C28為中心,碳數(shù)范圍為n-C20～C38,含量為0.17 mg/L;與MOSH對應(yīng)的MOAH也有2個駝峰,碳數(shù)范圍也集中在n-C16～C35(0.1 mg/L)。A9是清香型白酒,其MOSH和MOAH均只有1個駝峰,碳數(shù)范圍從n-C12到n-C40以上(以n-C28為中心),MOSH的含量為2.74 mg/L,MOAH的含量為1.24 mg/L。A8和A9的共同點在于均為金屬罐包裝。因此,其污染來源很可能來自金屬罐,金屬罐加工過程會接觸到潤滑劑,潤滑劑通過金屬包裝遷移進入白酒,引起污染[22]。

不過,同樣是金屬罐包裝的白酒A7并未檢出礦物油,說明規(guī)范的工藝可以避免礦物油污染。此外,塑料瓶包裝的A4也未檢出礦物油,其分析譜圖也沒有顯示出塑料遷移的聚烯烴寡聚飽和烴(polyolefin oligomeric saturated hydrocarbons,POSH)的特征峰[23]。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化液液萃取中正己烷-乙醇-水三相溶劑體系的比例,結(jié)合最新的HPLC-GC聯(lián)用技術(shù)建立了白酒、葡萄酒和啤酒中MOSH和MOAH的高靈敏度測定方法,定量限達到0.05 mg/L。應(yīng)用該方法調(diào)查了市售17個飲料酒產(chǎn)品中的礦物油含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),酒精度低的啤酒和葡萄酒中均未檢出污染,但白酒中有一半以上檢出污染,其中2個產(chǎn)品含有MOAH。數(shù)據(jù)分析表明,礦物油污染與生產(chǎn)廠家和包裝材料密切相關(guān)。