劉成琪,霍姝伊,王寧宇,胡梅梅,牛新月,王海寬

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

慢性結(jié)腸炎的病因是多方面的,通常表現(xiàn)為反復(fù)和持續(xù)的腹痛以及血性或化膿性腹瀉[1],發(fā)病早期腸上皮完整性被破壞,細(xì)菌及其產(chǎn)物穿過屏障滲漏,導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)和炎癥[2]。葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是應(yīng)用最廣泛的化學(xué)誘導(dǎo)小鼠慢性腸道炎癥模型,其操作簡單,且和人類慢性結(jié)腸炎有相同的病理學(xué)[3]特性,包括結(jié)腸內(nèi)膜上皮細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致促炎性腸內(nèi)容物擴(kuò)散到潛在組織中[3-4]。近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)慢性結(jié)腸炎和代謝紊亂之間存在相互作用,且它們的病理學(xué)具有共同的特征,包括代謝組織失調(diào)、炎癥以及免疫反應(yīng)不足[4]等。雖然目前有有效的藥物來幫助控制結(jié)腸炎癥狀,如免疫調(diào)節(jié)劑、皮質(zhì)類固醇、生物制劑和氨基水楊酸鹽,但其中一些藥物會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用[5]。因此,研究替代治療慢性結(jié)腸炎的方法尤為重要。

根據(jù)慢性結(jié)腸炎影響腸道微生物群和結(jié)腸的方式,目前益生菌和營養(yǎng)干預(yù)以其安全有效性越來越受歡迎。DING等[6]研究發(fā)現(xiàn),短乳桿菌可改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,適當(dāng)施用可能對宿主產(chǎn)生有益的健康影響,有助于緩解結(jié)腸炎癥狀。

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) TK1501在進(jìn)入人體后對機體的防御機制具有較強的耐受能力,可在人體腸道中大量存活并調(diào)節(jié)機體腸道菌群平衡,對人體的消化吸收功能有所增強。謝玉鋒等[7-8]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選出L.paracaseiTK1501,通過發(fā)酵豆?jié){驗證得到產(chǎn)品具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用,且該菌有較強的耐受能力,可作為緩解糖尿病的食品;源于L.paracaseiTK1501的β-葡萄糖苷酶對水解大豆異黃酮和合成糖苷發(fā)揮了重要作用。姜巖世等[9]發(fā)現(xiàn),經(jīng)過灌胃副干酪乳桿菌,小鼠免疫細(xì)胞顯著增殖,副干酪乳桿菌能夠調(diào)節(jié)小鼠免疫力。據(jù)報道,熱滅活微生物的制劑具有治療腹瀉、結(jié)腸炎、呼吸道疾病、腸道病變,以及對免疫系統(tǒng)的改變和改善腸道微生物群[10]的作用。經(jīng)過滅活的微生物相較于活性微生物,保質(zhì)期更長,且不易受溫度的影響,在環(huán)境溫度下便于儲存和運輸[11],因此熱處理滅活后的益生菌具有較好的發(fā)展前景。滅活后的益生菌對宿主有益,其中熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19具有良好的潤腸通便功能[12]。

紅棗營養(yǎng)豐富,富含維生素C、B1和B2以及類黃酮。紅棗不僅具有抗生育和抗糖尿病的作用[13],而且具有抗炎和止痛的特性。目前市場上所銷售的紅棗產(chǎn)品多以干制品以及粗加工為主,精加工棗產(chǎn)品種類較少。紅棗由于含糖量較高,發(fā)酵之后不僅增加了紅棗的營養(yǎng)價值,且口感良好,具有良好的市場前景。

本研究以DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠為模型,采用具有較強耐受能力且能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的L.paracaseiTK1501發(fā)酵滅活型紅棗飲品,探究L.paracaseiTK1501發(fā)酵的紅棗飲品對結(jié)腸炎的改善作用,以期為益生菌發(fā)酵飲品治療腸道疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

副干酪乳桿菌TK1501(L.paracaseiTK1501),保藏編號為CGMCC No.13130;寧夏同心圓棗干棗。

1.1.2 實驗動物

40只SPF級健康雄性BALB/c小鼠,體質(zhì)量(20±2) g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司;飼養(yǎng)條件：12 h光照/12 h黑夜循環(huán),溫度(22±2) ℃,濕度50%～60%,用固體普通鼠糧飼養(yǎng),自由飲食飲水。實驗動物獲得動物實驗管理委員會(IACUC-JKX-2008-1)的批準(zhǔn)。

1.1.3 試劑及儀器

MRS培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡聚糖硫酸鈉(MP級),百奧泰生物制藥股份有限公司;甲醇(色譜純),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;ELISA試劑盒,南京建成生物技術(shù)有限公司;便潛血試劑盒,萬馬醫(yī)療器械有限公司;1500酶標(biāo)儀,芬蘭Thermo ELECTRON CORPORATION;Stepone Plus實時熒光定量PCR儀,ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.paracaseiTK1501棗漿發(fā)酵液的制備

料水比1∶4(g∶mL)的紅棗勻漿后進(jìn)行巴氏殺菌,備用。在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)L.paracaseiTK1501三級種子液,按體積分?jǐn)?shù)為10%接種量接入紅棗勻漿中,37 ℃密閉發(fā)酵24 h。發(fā)酵完成后再次進(jìn)行巴氏殺菌。

1.2.2 動物分組及模型的構(gòu)建

40只BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分組,分組采用隨機數(shù)字表法,每組10只,共分為4組,分別是空白組、DSS模型組、實驗組、對照實驗組,具體分組如表1。

表1 實驗分組Table 1 Experimental grouping

本實驗采用改良的自由飲用一定濃度的DSS溶液方法構(gòu)建慢性UC模型?？瞻捉M小鼠實驗期間均不予干預(yù),其余3組小鼠自由飲用30 g/L的DSS溶液進(jìn)行建模,每次飲用時間7 d。第8天起改為飲用蒸餾水,每次飲用蒸餾水時間7 d,以上14 d為1個周期,整個模型構(gòu)建階段共3個周期,合計42 d,實驗前期適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,共計47 d。最后1個周期給予相應(yīng)發(fā)酵液灌胃干預(yù),模型組用生理鹽水進(jìn)行對照灌胃,具體情況如表2所示。

表2 建模及給藥時間表Table 2 Modeling and dosing schedule

1.2.3 疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分的測定

實驗期間每天記錄小鼠體質(zhì)量并觀察小鼠情況和便質(zhì),化驗便潛血。根據(jù)表3的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各項評分,體質(zhì)量下降率、便質(zhì)、便潛血3項指標(biāo)評分總和除以3即為小鼠DAI評分,參照公式(1)計算。

(1)

式中：a,體質(zhì)量下降率評分;b,便質(zhì)評分;c,便隱血評分。

表3 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 DAI scoring standards

1.2.4 炎癥因子的測定及結(jié)腸長度測定和固定

實驗終點采用眼球取血法收集血液標(biāo)本,分離血清。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附ELISA試劑盒說明書檢測IL-4、IL-6、TNF-α、IL-1β細(xì)胞因子含量。取血后進(jìn)行解剖,取出結(jié)直腸段,測量其長度,剪取0.5 cm左右的結(jié)腸組織放入40 g/L多聚甲醛中進(jìn)行固定,送至津科生物科技有限公司進(jìn)行切片制備。剩余結(jié)直腸冷凍備用。

1.2.5 蛋白表達(dá)量的檢測

將結(jié)直腸取出,通過RT-PCR技術(shù),檢測結(jié)直腸中緊密連接蛋白ZO-1,Occludin,黏蛋白MUC2的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.paracasei TK1501紅棗發(fā)酵液對UC模型小鼠DAI評分的影響

DAI是一種用于評價小鼠疾病程度的評分,評分結(jié)果見表4。與空白組小鼠相比,經(jīng)30 g/L DSS誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量顯著降低,糞便為稀便或水便,糞便中的血液也肉眼可見。

表4 DAI評分記錄表Table 4 DAI score record

由圖1可知,DSS模型組的 DAI評分顯著高于空白組(P<0.01),表明UC模型成功建立;實驗組的DAI指數(shù)顯著低于DSS模型組(P<0.01),對照組的DAI指數(shù)與DSS模型組無明顯差異,說明副干酪TK1501發(fā)酵棗漿可以減輕結(jié)腸炎的疾病癥狀,對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠具有一定的保護(hù)作用。

BG-空白組;MG-DSS模型組;TG1-實驗組;TG2-對照實驗組(下同)圖1 小鼠DAI評分柱形圖Fig.1 Histogram of DAI score in mice

2.2 L.paracasei TK1501紅棗發(fā)酵液對UC模型小鼠結(jié)直腸長度的影響

結(jié)腸長度與結(jié)腸炎疾病具有密切相關(guān)性,是對UC評價的重要指標(biāo)之一,圖2數(shù)據(jù)表明,本次試驗中空白組小鼠結(jié)腸長度最長,模型組小鼠的結(jié)腸長度顯著(P<0.01)短于空白組,而實驗組小鼠的結(jié)腸長度顯著(P<0.01)長于模型組。表明TK1501發(fā)酵的紅棗漿可有效恢復(fù)由DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠結(jié)腸長度,對結(jié)腸炎癥狀有輕微改善作用。

圖2 小鼠結(jié)腸長度柱形圖Fig.2 Histogram of colon length in mice

2.3 L.paracasei TK1501紅棗發(fā)酵液對UC模型小鼠細(xì)胞因子影響

參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞炎癥因子主要可分為促炎因子和抗炎因子兩大類。當(dāng)有炎癥發(fā)生時,血液中的細(xì)胞因子會發(fā)生相應(yīng)的變化,促炎因子白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等會大量釋放,含量出現(xiàn)明顯增加,抗炎因子白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)的生成會被抑制,導(dǎo)致炎癥加劇[14]。圖3中模型組的IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著(P<0.01)高于空白組,其IL-4含量顯著低于空白組。說明實驗成功建立了UC模型,模型組的小鼠發(fā)生了炎癥反應(yīng),實驗組的IL-1β、IL-6、TNF-α顯著(P<0.01)低于模型組,IL-4含量顯著高于模型組。表明L.paracaseiTK1501發(fā)酵的紅棗漿可上調(diào)UC模型小鼠的抗炎因子,下調(diào)促炎因子,有效調(diào)節(jié)由DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠細(xì)胞因子含量,對結(jié)腸炎癥狀有一定改善作用。

2.4 L.paracasei TK1501紅棗發(fā)酵液對UC模型小鼠結(jié)直腸蛋白表達(dá)量的影響

有研究表明,Occludin蛋白是最具有代表性的緊密連接蛋白之一,它能夠封閉細(xì)胞旁路,使組織機構(gòu)緊密連接。結(jié)直腸中的Occludin表達(dá)量過低容易導(dǎo)致腸的上皮屏障被破壞,引發(fā)一系列腸道疾病[15]。此外,腸道上皮中杯狀細(xì)胞分泌的MUC-2也是屏障的重要組成部分,MUC-2是黏蛋白的一種,對腸屏障的完整性恢復(fù)腸道正常功能具有重要意義[16]。經(jīng)發(fā)酵飲品干預(yù)后的UC模型小鼠蛋白表達(dá)量的結(jié)果如圖4所示,模型組的Occludin、MUC-2蛋白表達(dá)量顯著(P<0.01)低于空白組,說明UC模型已建立,模型組小鼠腸道中連接蛋白和黏蛋白表達(dá)量降低,出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。實驗組的Occludin、MUC-2蛋白表達(dá)量顯著(P<0.01)高于模型組,表明經(jīng)L.paracaseiTK1501紅棗發(fā)酵液干預(yù)后的UC小鼠結(jié)腸中鏈接蛋白和黏蛋白的表達(dá)量增加,腸道屏障功能有所恢復(fù),結(jié)腸炎癥狀有效改善。

a-IL-4;b-IL-1β;c-IL-6;d-TNF-α圖3 小鼠細(xì)胞炎癥因子柱形圖Fig.3 Histogram of mouse inflammatory cytokines

圖4 小鼠結(jié)腸蛋白表達(dá)量柱形圖Fig.4 Histogram of protein expression in mouse colon

2.5 L.paracasei TK1501紅棗發(fā)酵液對UC模型小鼠結(jié)腸組織病理影響

病理切片觀察如圖5所示,圖5-a中杯狀細(xì)胞排列緊密隱窩結(jié)構(gòu)正常,無明顯脫落現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象;圖5-b中上皮細(xì)胞有輕度的脫落現(xiàn)象,杯狀細(xì)胞較為松散,隱窩結(jié)構(gòu)輕度破壞,部分位置有少量炎癥細(xì)胞浸潤;圖5-c中有輕度脫落現(xiàn)象,隱窩結(jié)構(gòu)輕度破壞,無炎癥細(xì)胞浸潤。通過病理切片觀察發(fā)現(xiàn),TK1501紅棗發(fā)酵液干預(yù)后的結(jié)腸炎小鼠病理切片的炎癥現(xiàn)象有所改善,腸壁結(jié)構(gòu)被破壞的現(xiàn)象也有所減輕。

a-空白組;b-DSS模型組;c-實驗組圖5 小鼠結(jié)腸病理切片圖Fig.5 Pathological section of mouse colon

3 結(jié)論與討論

慢性結(jié)腸炎在中國的發(fā)病率約0.12%,并且呈指數(shù)上升趨勢。近些年,隨著UC發(fā)病率的增加,其有效的預(yù)防和治療已成為慢性結(jié)腸炎研究重點。由于結(jié)腸炎的病因尚不明確,所以臨床上沒有針對此病癥的特效藥。目前用于治療慢性結(jié)腸炎的藥物均有維持效果不佳的缺點,一旦患有結(jié)腸炎除手術(shù)外很難痊愈,所以腸炎患者日常的飲食應(yīng)多加注意。

副干酪乳桿菌代謝過程中會分泌或釋放對宿主產(chǎn)生有益影響的可溶性因子[17],包括胞外多糖、核糖體產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)等具有免疫特性的物質(zhì),即后生素。在易感染患者和新生兒[18]等患者群體中,由于細(xì)菌要從腸道轉(zhuǎn)移到體循環(huán),使用活菌會出現(xiàn)一定的安全問題,因此人們對使用熱滅活益生菌的興趣有所增加。細(xì)菌經(jīng)過熱處理滅活后,作為益生菌的乳酸菌細(xì)胞表面的肽聚糖、磷酸壁、蛋白等成分對宿主具有有益作用。而且乳桿菌菌株分泌的代謝產(chǎn)物的有益效果更為顯著,其中包括蛋白質(zhì)、肽、有機酸和其他小分子,由活細(xì)菌分泌或在細(xì)菌裂解后釋放到宿主環(huán)境中,并賦予宿主各種生理益處。目前關(guān)于熱滅活細(xì)菌對健康有益的現(xiàn)有證據(jù)表明,它們可以是脆弱人群(如新生兒)活益生菌的安全替代品[19],并且在兒童和成人胃腸疾病的管理中也有作用,包括腹脹和腹瀉[20]。乳桿菌屬物種通過分泌聚集促因子蛋白,即胞外蛋白,使乳桿菌菌株能夠在胃腸道定殖,并通過競爭排斥或與病原體共聚集來抑制病原體的黏附[21]。細(xì)菌素是一類核糖體合成的抗菌肽,具有殺菌或抑菌功能。YE等[22]報道了來自副干酪乳桿菌的細(xì)菌素具有耐高溫和耐酸的特性,對于許多食源性病原體具有廣譜抑制作用。

副干酪乳桿菌的代謝產(chǎn)物具有保護(hù)上皮屏障、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和對病原體的拮抗作用等有益功能[23],相較于菌體本身具有更長的保質(zhì)期、清晰的化學(xué)結(jié)構(gòu)和安全劑量參數(shù)等優(yōu)勢。因此,使用益生菌代謝產(chǎn)物可能是活菌的有效和更安全的替代物,而且顯示出替代益生菌的良好潛力。目前,益生菌代謝產(chǎn)物在人類食品、動物飼料和制藥工業(yè)中的應(yīng)用越來越多,幾種來源于乳酸菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)品可用于預(yù)防或治療某些疾病[23]?？傃灾?益生菌代謝產(chǎn)物作為人類或動物使用的預(yù)防或治療劑以及功能性食品或飼料添加劑具有良好的潛力。

本研究中通過L.paracaseiTK1501發(fā)酵的紅棗飲品具有改善結(jié)腸炎這一功能性。本研究的數(shù)據(jù)顯示,經(jīng)L.paracaseiTK1501發(fā)酵的紅棗飲品可以顯著降低結(jié)腸炎小鼠的DAI,同時緩解結(jié)腸炎所造成的結(jié)腸萎縮。結(jié)腸炎模型小鼠細(xì)胞中促炎因子IL-1β、IL-6水平較高,抗炎因子IL-4水平較低,相關(guān)連接蛋白的表達(dá)量下降;L.paracaseiTK1501發(fā)酵的紅棗飲品的干預(yù)使促炎因子IL-1β、IL-6有所下調(diào),抗炎因子IL-4有所上調(diào)。此外,L.paracaseiTK1501發(fā)酵紅棗飲品可以使結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中Occludin、MUC-2兩種蛋白mRNA相對表達(dá)量顯著升高,同時減輕結(jié)腸炎小鼠的病理學(xué)改變。這些結(jié)果表明L.paracaseiTK1501發(fā)酵的紅棗飲品具有改善慢性結(jié)腸炎的作用,是一款功能性飲品。此外,大量研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)腸道菌群,對腸道疾病有明顯的改善作用[24]。L.paracaseiTK1501發(fā)酵紅棗飲品還可能對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的含量有所影響,如短鏈脂肪酸等,此項研究工作目前正在開展,以期進(jìn)一步闡述L.paracaseiTK1501發(fā)酵紅棗飲品對結(jié)腸炎的改善作用。

本文研究結(jié)果為紅棗發(fā)酵飲品的開發(fā)及營養(yǎng)應(yīng)用提供了理論支持。紅棗中含有的抗氧化活性物質(zhì)對人體有益,經(jīng)發(fā)酵后的飲品經(jīng)過巴氏殺菌后不含活菌,可以避免活菌攝入引起腸道菌群的改變。此飲品的研發(fā)具有積極的意義和應(yīng)用價值。