宋梟，薛逸文，郝靜，鄧潤智

南京大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院南京市口腔醫(yī)院副院長辦公室，江蘇 南京 210008

慢性牙周炎是口腔頜面部常見的疾病，其最終導致的牙槽骨吸收和牙齒松動、脫落，是成年人失牙的主要原因之一[1]。牙周炎的良好控制可以幫助患者恢復咀嚼功能，促進心理健康，提高生活質(zhì)量。與其他因腫瘤、外傷或先天性畸形導致的組織缺損再生修復不同，牙周組織再生是在慢性感染性破壞區(qū)進行，組織再生修復區(qū)即是炎癥破壞區(qū)。研究顯示，牙周組織局部的感染環(huán)境影響牙周新附著的形成，最終導致組織再生修復失敗[2]。故而在牙周組織工程中，局部的炎癥環(huán)境調(diào)控顯得尤為重要。在受到組織損傷及急性炎癥刺激后巨噬細胞是最早遷移至組織缺損區(qū)的免疫細胞[3]，同時巨噬細胞也是體外成骨細胞分化所必須的，在組織再生修復的不同時期都扮演著至關(guān)重要的角色。然而巨噬細胞調(diào)控組織再生修復的具體機制仍有待研究。外泌體(exosome)是由細胞分泌、直徑在30～140 nm的納米級囊泡[4]，其功能主要為在細胞間轉(zhuǎn)運相關(guān)物質(zhì)從而實現(xiàn)供受體細胞之間的物質(zhì)交換和信息交流[5]。在牙周炎的環(huán)境中巨噬細胞是否也通過外泌體來實現(xiàn)與成骨細胞間的信息交互，目前仍需要進一步探究。為明確外泌體在巨噬細胞與成骨細胞的串擾間所扮演的角色，本研究通過體外培養(yǎng)巨噬細胞，成功分離并提取了巨噬細胞源性外泌體，并對其表征與標記蛋白進行鑒定，有望為牙周組織再生修復研究提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 細胞 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要儀器和試劑 細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)，高速離心機(美國Thermo 公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon 公司)，超速離心機(美國Thermo 公司)，透射電鏡(日本Hitachi 公司)，粒徑分析儀(廈門NanoFCM公司)，多功能酶標儀(美國Thermo公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海CLINX 公司)，DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素和胎牛血清FBS (美國Gbico 公司)，PBS緩沖液(美國Hycone 公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(上海Beyotime 公司)，兔單克隆抗體CD9、CD81、TSG101、Calnexin(英國Abcam公司)。

1.3 細胞培養(yǎng) 在37℃、含有5%CO2的潮濕環(huán)境中，使用含有1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將凍存的RAW264.7 細胞系復蘇至150 mm 直徑大培養(yǎng)皿中，待細胞生長密度達到90%左右時棄掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗細胞3次，為排除胎牛血清中外泌體干擾，預先使用超速離心機將血清4℃，11000×g 離心10 h，取上清，以去除血清中外泌體，隨后以含有10%去除外泌體的胎牛血清和1%抗生素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后收集細胞培養(yǎng)上清液于離心管，4℃、1500×g 離心20 min去除細胞及細胞碎片，將收集到的上清液于-80℃冰箱凍存，用于后續(xù)實驗。

1.4 外泌體提取 外泌體提取12 h 前將凍存的上清液置于4℃冰箱自然解凍，使用0.22 μm 濾器過濾上清液中含有的胞外囊泡，凋亡小體等粒徑大于200 nm的顆粒，然后使用高速離心機4℃、17000×g離心15 min去除上清液中殘留細胞器，最后使用超速離心機4℃、110000×g離心80 mim，棄去上清，可見離心管底部微量白色沉淀即為外泌體，取磷酸鹽(PBS)緩沖液重懸后于-80℃冰箱凍存用于后續(xù)實驗。

1.5 BCA 試劑盒測定外泌體的含量 首先使用等量RIPA裂解液將外泌體樣本置于冰上裂解10 min，隨后按照BCA試劑盒說明書進行濃度測定，具體操作如下，首先配制終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準品，根據(jù)樣品數(shù)量，按50∶1 配置適量BCA 工作液，充分混勻。接下來將標準品按0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL 分別加到96 孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL，隨后加入20 μL體積外泌體樣品到96 孔板中，并設(shè)置3 個復孔，加樣完畢后，各孔加入200 μL BCA 工作液，37℃放置20～30 min，用酶標儀測定562 nm吸光度，繪制標準曲線并計算外泌體的蛋白濃度。

1.6 透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)及大小 取10 μL外泌體樣本滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，隨后滴加10 μL 2%醋酸雙氧鈾滴于銅網(wǎng)上染色1 min，濾紙吸去浮液，于室溫自然干燥后100 kV條件下進行電鏡檢測成像，拍照記錄外泌體的形態(tài)大小。

1.7 外泌體樣品粒徑分析 取外泌體樣本10 μL，用DEPC水稀釋50 倍備用，先用標準品進行儀器性能測試合格后進行外泌體上樣，注意需進行梯度稀釋以避免樣本堵塞進樣針，待樣本完成檢測即可獲得外泌體粒徑及濃度信息。

1.8 Western blot 實驗 首先配制濃度為10%或15%的SDS PAGE電泳膠，同時取含40 μg外泌體樣本和40 μg 經(jīng)過提純后的外泌體標準品(對照)于1.5 mL EP 管中，每管加入30 μL 5×loading buffer，95℃煮10 min 使樣品中的蛋白變性；將蛋白樣品及Maker按順序加入上樣孔內(nèi)，140V 恒壓下電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下于5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，與下列一級抗體孵育：anti-CD9(1∶300)，anti-CD81(1∶300)，anti-TSG101(1∶300)，anti-Calnexin (1 ∶300)，隨后使用合適的二級抗體IgG-HRP 結(jié)合對印跡進行染色，加入ECL 顯影液顯影，凝膠成像儀拍照記錄蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的含量 使用200 μL PBS 緩沖液將325 mL 巨噬細胞培養(yǎng)基中提取的外泌體重懸，根據(jù)562 nm 處不同濃度蛋白標準品的吸光度值繪制標準曲線，見圖1，通過BCA法計算可得外泌體蛋白濃度約為2.2304 mg/mL，所收集RAW264.7 細胞外泌體共計約446 μg。

2.2 外泌體的形態(tài)及大小 在透射電鏡觀察下，以超速離心和超濾法獲取的RAW264.7細胞來源的外泌體呈現(xiàn)為內(nèi)部含有不均勻的低電子密度物質(zhì)的囊泡狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑約為81.20 nm，呈單個散在分布或聚集分布，見圖2。

圖2 外泌體形態(tài)圖

2.3 外泌體的粒徑及濃度 外泌體的粒徑及濃度示意圖見圖3，顯示大多數(shù)的外泌體粒徑集中在70～100 nm，其平均粒徑為81.20 nm，濃度為(2.90E+10)Particles/mL。

圖3 外泌體的粒徑及濃度示意圖

2.4 Western blot實驗 Western blot結(jié)果見圖4，與陽性對照組相比，陽性標記蛋白CD9 及TSG101 均在所提取的外泌體中表達，且表達豐度較高，陰性標記蛋白Calnexin 則無表達，進一步說明了該提取方法成功從巨噬細胞上清液中提取出了外泌體。

圖4 Western Blot結(jié)果

3 討論

近年來對于牙周組織再生的研究主要圍繞干細胞移植和生物材料兩個領(lǐng)域。然而這兩種治療方法都有一定的缺點，干細胞移植存在致畸、栓塞、倫理等問題[6]，生物材料的毒性和免疫原性也可能導致嚴重的并發(fā)癥。越來越多的研究表明外泌體具有組織修復潛力，外泌體可以有效地刺激組織和器官，包括心臟[7]、肺[8]、腎[9]等的再生，也可以在體外和體內(nèi)促進骨再生，同時可以避免直接干細胞移植帶來的風險[10]。而其中關(guān)于巨噬細胞源外泌體的研究現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤、炎癥及骨再生等領(lǐng)域，在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞通過外泌體與胰腺導管腺癌細胞和上皮性卵巢癌細胞溝通從而誘導其產(chǎn)生化療耐藥性[11]，在頭頸部鱗狀細胞癌中外泌體也同樣參與巨噬細胞和癌細胞間的通訊，為頭頸癌治療干預提供了潛在靶點[12]。同時，M2型巨噬細胞外泌體可以促進小鼠缺血后肢血管生成及骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化[13-14]，且在心臟損傷期間，炎性巨噬細胞衍生的含有miR-155 的外泌體抑制了成纖維細胞增殖并促進成纖維細胞的炎癥反應(yīng)[15]。而目前在牙周組織再生領(lǐng)域中，巨噬細胞外泌體是否也扮演著重要的角色目前尚未可知。因此通過對巨噬細胞外泌體的提取與研究有望為臨床上實現(xiàn)牙周組織再生提供了一種新的潛在治療方法。

由于外泌體是直徑在30～140 nm 的納米級囊泡，其高效的提取方式一直是外泌體研究中一個亟待解決的難題[16]，目前在各種已有的研究中使用較廣泛的三種外泌體提取方法分別是密度梯度超速離心法、超速離心和超濾結(jié)合法、外泌體試劑盒提取法。其中超速離心和超濾結(jié)合法經(jīng)研究者證實在提取外泌體的性價比方面最高[17]。外泌體蛋白組成主要分為兩類，一類是公共部分，在囊泡的形成和分泌過程中普遍存在的蛋白，包括跨膜轉(zhuǎn)運和融合相關(guān)蛋白(如Rab、GTPases)、熱休克蛋白(如HSP70、HSP90)、四肽跨膜蛋白(如CD63、CD81、CD9)及ESCRT 復合物相關(guān)蛋白(如TSG101、Alix)等，其中CD63、CD81、CD9、TSG101在外泌體中高度富集，已成為外泌體的常用標記蛋白[18]。本研究中使用該方法提取的外泌體平均粒徑為81.20 nm，Western blot結(jié)果中陽性指標CD9及TSG101均在所提取的外泌體中表達，陰性指標Calnexin 無表達等基本特征符合文獻要求，成功提取出了巨噬細胞外泌體。目前最常用的外泌體保存技術(shù)仍然是低溫保存技術(shù)，即保存于-80℃或-196℃，此種保存形式的外泌體生物活性在提取后20 d 內(nèi)最佳，但這種保存方式容易發(fā)生凍傷，因此在保存時添加適宜濃度的雙糖防凍劑是最佳選擇，其中海藻糖被列為最有效的雙糖防凍劑[19]。

本研究使用超速離心和超濾結(jié)合法成功提取了巨噬細胞來源的外泌體，并對其表征及標記蛋白進行了觀察與鑒定。驗證了該方法用于提取巨噬細胞外泌體的可行性，并對巨噬細胞外泌體的現(xiàn)有研究、提取方案及改善措施進行了討論。為進一步研究巨噬細胞外泌體在牙周炎中的作用奠定了基礎(chǔ)，并為當前外泌體的提取提供了一定的參考。