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        變應(yīng)性鼻炎患者外周血PBMC中miR-146a和STAT5b的表達(dá)及臨床意義

        2022-04-18 09:26:16王忠勛楊超曹永華
        海南醫(yī)學(xué) 2022年7期
        關(guān)鍵詞:癥狀

        王忠勛,楊超,曹永華

        陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 西安 712000

        過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一種常見的過敏性疾病,受過敏原影響,在多種細(xì)胞因子的參與下,涉及IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放的鼻黏膜炎癥反應(yīng),病情嚴(yán)重者伴有哮喘[1-2]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一種廣泛存在于生命中的正常調(diào)控機(jī)制,參與癌癥、代謝疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染病和自身免疫性疾病過程,廣泛存在于患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)、血漿和血清中[3]。根據(jù)生理狀況、疾病類型和病程,miRNA 分子的類型和數(shù)量會(huì)發(fā)生變化。miR-146 可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和T 細(xì)胞活化[4]。JAK-STAT(Janus 激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子)是一種進(jìn)化保守的信號(hào)通路,可以參與過敏性鼻炎、哮喘等炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生[5]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STATs)位于自身免疫和炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞因子下游,也與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病有關(guān)。STAT5b 屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族,研究發(fā)現(xiàn)其異常激活和過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián),但與AR的關(guān)系尚不清楚[6]。本研究主要探討AR 患者PBMC 中微小RNA-146a(miR-146a)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5b (STAT5b)的表達(dá)水平及其臨床意義。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年12月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院治療的87 例變應(yīng)性鼻炎患者納入觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷符合《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)年齡≥18 歲;(3)近1 個(gè)月內(nèi)未使用抗過敏藥物或鼻部噴劑等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)伴有鼻息肉、鼻竇炎等其他鼻部疾病;(2)有肝腎功能障礙、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)性疾病等其他嚴(yán)重疾?。?3)合并有結(jié)核、HIV 感染。同時(shí)選取在我院治療的鼻中隔偏曲患者80 例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)無鼻息肉、鼻竇炎及變應(yīng)性癥狀;(2)變應(yīng)原皮試無陽性反應(yīng),血清特異性IgE 陰性;(3)年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)近1個(gè)月內(nèi)接受過激素、抗組胺及免疫治療者;(2)合并有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能障礙等其他疾病。兩組患者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者及家屬知情并簽署同意書。

        表1 兩組患者的一般資料比較

        1.2 觀察指標(biāo)與檢測方法 (1)外周血單個(gè)核細(xì)胞的提?。悍謩e抽取兩組患者外周靜脈血4 mL進(jìn)行抗凝。PBMCs 通過密度梯度離心,分離的乳白色PBMCs層加入1 mL PBS稀釋得到BMCs懸液。(2)采用PT-PCR 檢測PBMC 中miR-146a 表達(dá):①BMCs 總RNA的提取:將兩組患者的PBMCs懸液使用Trizol法提取總RNA后加入35 μL RNase-free水在60℃水浴下5~10 min,使用核酸紫外分析儀檢測RNA 濃度,保證OD260/280為1.8~2.0,電泳檢測RNA含量。②逆轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)體系:將兩組患者的PBMCs 中提取的總RNA 用RNase-free水稀釋至2 ng/μL的濃度。RNA模板2 μL,RT引物2 μL,5×RT緩沖液5 μL,dNTP(2.5 mm)2 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL,20 U/μLRT 酶0.5 μL,ddH2O24 μL。以β-actin 為內(nèi)參基因,cDNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)系統(tǒng):cDNA 2 μL,2×SYBR Green qPCR 混合物10 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,焦碳酸二乙酯6 μL的二乙氧基碳酸氫鹽(DEPC)水,總反應(yīng)量20 μL,重復(fù)3 次,反應(yīng)條件:95℃10 min;95℃15 min;60℃1 min;40 循 環(huán),72℃30 s。 使 用qRT-PCR 儀擴(kuò)增操作,使用2-ΔΔCT方法計(jì)算miR-146a表達(dá)的相對(duì)表達(dá)。(3)Western blot檢測STAT5b表達(dá):將蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物加入到RIPA 緩沖液中,按照蛋白質(zhì)提取程序提取PBMC 蛋白后,10%SDS-PAGE 電泳分離,電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,PVDF 膜封閉后一抗孵育:抗-STAT5b 和抗GAPDH,洗膜,然后二抗孵育2 h,洗膜,顯影分析結(jié)果。GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。

        1.3 鼻部癥狀評(píng)分[8]對(duì)流涕、噴嚏、鼻塞、眼癢和咽癢等癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià),每項(xiàng)癥狀評(píng)分為0~3分,其中0分為無癥狀,1 分為癥狀較輕,2 分為癥狀明顯,且影響日?;顒?dòng),3 分為癥狀嚴(yán)重,影響患者睡眠和日常活動(dòng)。各項(xiàng)評(píng)分之和,≤6 分為輕度,>6 分為中重度患者。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料首先行正態(tài)分布檢驗(yàn),符合正態(tài)分布則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用Pearson 分析miR-146a、STAT5b 相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分的相關(guān)性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組患者PBMC 中的miR-146a、STAT5b 表達(dá)水平比較 觀察組患者PBMC 中的miR-146a 和STAT5b相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

        表2 兩組患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

        表2 兩組患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

        組別觀察組對(duì)照組t值 P值例數(shù)8780 miR-146a 2.15±0.983.65±1.00-9.7850.001 STAT5b 0.58±0.181.53±0.34-22.8190.001

        2.2 不同臨床特征AR 患者的miR-146a 表達(dá)水平比較 觀察組中重度患者PBMC中miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯低于輕度患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而不同性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和變應(yīng)原患者PBMC 中的miR-146a 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

        表3 不同臨床特征AR患者的miR-146a表達(dá)水平比較(±s)

        表3 不同臨床特征AR患者的miR-146a表達(dá)水平比較(±s)

        臨床資料性別男女年齡(歲)≤30>30體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)<24≥24變應(yīng)原混合真菌其他病情程度輕度中重度例數(shù)50375829553253343948 miR-146a相對(duì)表達(dá)量2.18±0.952.11±0.992.13±0.912.19±0.872.11±0.942.22±0.982.16±0.912.13±0.872.41±0.971.94±0.92 t值0.334-0.294-0.5180.1532.313 P值0.7390.7690.6060.8790.023

        2.3 不同臨床特征AR 患者的STAT5b 表達(dá)水平比較 觀察組中重度患者PBMC 中STAT5b 相對(duì)表達(dá)量明顯低于輕度患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而不同性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和變應(yīng)原患者PBMC 中STAT5b 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。

        表4 不同臨床特征AR患者的STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

        表4 不同臨床特征AR患者的STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

        臨床資料性別男女年齡(歲)≤30>30體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)<24≥24變應(yīng)原混合真菌其他病情程度輕度中重度例數(shù)50375829553253343948 STAT5b相對(duì)表達(dá)量0.60±0.140.55±0.160.56±0.160.62±0.140.56±0.130.61±0.160.59±0.120.56±0.130.79±0.200.41±0.16 t值1.55-1.716-1.5871.1019.848 P值0.1250.0900.1160.2740.001

        2.4 miR-146a、STAT5b 相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分的相關(guān)性 觀察組患者PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.544、-0.577,P<0.05),miR-146a 和STAT5b 呈正相關(guān)(r=0.645,P<0.05),見圖1。

        圖1 miR-146a、STAT5b相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分的相關(guān)性

        3 討論

        變應(yīng)性鼻炎全球發(fā)病率較高,患者癥狀為持續(xù)性鼻癢、打噴嚏、流鼻涕等,是哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)因素[9-10]。變應(yīng)性鼻炎的治療方法主要是進(jìn)行過敏原特異性免疫療法來有效恢復(fù)人體免疫力,但該方法的治療時(shí)間較長,可能出現(xiàn)全身性超敏反應(yīng)[11-12]。隨著人們對(duì)變應(yīng)性鼻炎疾病認(rèn)識(shí)的加深,他們發(fā)現(xiàn)免疫失衡不足以解釋變應(yīng)性鼻炎炎癥反應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)數(shù)量的變化或功能喪失在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[14]。近年來,miRNA 的功能為AR發(fā)生機(jī)制和治療方法提供思路,其中miR-146 是Treg 細(xì)胞中表達(dá)量最高的miRNA 之一,其參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(ROCK1),增加轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[15]。

        JAK-STAT 與多種炎癥和自身免疫性疾病有關(guān),受到激活時(shí)會(huì)發(fā)生酪氨酸磷酸化和二聚化,形成特殊的信號(hào)傳遞結(jié)構(gòu),向細(xì)胞核傳遞細(xì)胞因子信號(hào),參與免疫調(diào)節(jié)和免疫細(xì)胞的產(chǎn)生[16]。先前的實(shí)驗(yàn)表明,STAT5b 也在Treg 細(xì)胞中起著重要作用[17-18]。筆者認(rèn)為miR-146a通過調(diào)節(jié)STAT5b 來參與AR的發(fā)生和發(fā)展。STAT5a 和5b 亞型具有高度同源性,但STAT5b的敲除會(huì)使Treg 細(xì)胞的功能維持受影響,而STAT5a則不會(huì)引起對(duì)細(xì)胞的影響[19],因此,本研究針對(duì)STAT5b進(jìn)行研究。

        本研究結(jié)果顯示,觀察組外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。這與已有研究結(jié)果[20]一致,筆者猜測miR-146a調(diào)節(jié)STAT5b 的表達(dá)使Treg 分化,患者外周血Treg 細(xì)胞減少,影響患者免疫調(diào)節(jié)功能,導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生。miR-146a和STAT5b表達(dá)水平與變應(yīng)性鼻炎的疾病活動(dòng)度有關(guān)。本研究中,觀察組中重度患者外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對(duì)表達(dá)量明顯低于 輕 度 患 者(P<0.05),進(jìn) 一 步 驗(yàn) 證miR-146a 和STAT5b 水平與患者病情密切相關(guān)。推測miR-146a可能通過調(diào)節(jié)STAT5b 信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能,參與外周血Treg 細(xì)胞的分化和功能維持在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用。

        本研究通過相關(guān)性分析證明miR-146a 可以正向調(diào)控STAT5b的表達(dá)以影響Treg細(xì)胞的分化。然而,本研究不能證實(shí)miR-146a是否是級(jí)聯(lián)反應(yīng)中STAT5b的表達(dá)和激活所必需的,還需要進(jìn)一步對(duì)機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。

        目前臨床中缺少外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 的表達(dá)水平與變應(yīng)性鼻炎病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系研究,本研究具有一定的創(chuàng)新性,證實(shí)在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過程中,免疫功能增強(qiáng)和炎性細(xì)胞因子激活起重要作用,STAT5b 可以調(diào)節(jié)外周血Treg 細(xì)胞的分化,為變應(yīng)性鼻炎的臨床治療提供新思路和新靶點(diǎn),具有一定的研究價(jià)值。但本研究缺少相應(yīng)機(jī)制的研究,缺乏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持,存在一定的局限性,需要進(jìn)一步探究。

        綜上所述,變應(yīng)性鼻炎患者外周血PBMC 中miR-146a 含量和STAT5b 表達(dá)水平下調(diào),與患者病情程度呈負(fù)相關(guān),同時(shí)兩者間存在正相關(guān)關(guān)系。

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