王忠勛，楊超，曹永華

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科，陜西 西安 712000

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是一種常見的過敏性疾病，受過敏原影響，在多種細(xì)胞因子的參與下，涉及IgE 介導(dǎo)的介質(zhì)釋放的鼻黏膜炎癥反應(yīng)，病情嚴(yán)重者伴有哮喘[1-2]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一種廣泛存在于生命中的正常調(diào)控機(jī)制，參與癌癥、代謝疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、傳染病和自身免疫性疾病過程，廣泛存在于患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)、血漿和血清中[3]。根據(jù)生理狀況、疾病類型和病程，miRNA 分子的類型和數(shù)量會(huì)發(fā)生變化。miR-146 可以調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)和T 細(xì)胞活化[4]。JAK-STAT(Janus 激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子)是一種進(jìn)化保守的信號(hào)通路，可以參與過敏性鼻炎、哮喘等炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生[5]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STATs)位于自身免疫和炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中細(xì)胞因子下游，也與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病有關(guān)。STAT5b 屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族，研究發(fā)現(xiàn)其異常激活和過度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，但與AR的關(guān)系尚不清楚[6]。本研究主要探討AR 患者PBMC 中微小RNA-146a(miR-146a)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5b (STAT5b)的表達(dá)水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年12月在陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院治療的87 例變應(yīng)性鼻炎患者納入觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷符合《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》中的標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)年齡≥18 歲；(3)近1 個(gè)月內(nèi)未使用抗過敏藥物或鼻部噴劑等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有鼻息肉、鼻竇炎等其他鼻部疾病；(2)有肝腎功能障礙、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)性疾病等其他嚴(yán)重疾?。?3)合并有結(jié)核、HIV 感染。同時(shí)選取在我院治療的鼻中隔偏曲患者80 例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無鼻息肉、鼻竇炎及變應(yīng)性癥狀；(2)變應(yīng)原皮試無陽性反應(yīng)，血清特異性IgE 陰性；(3)年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個(gè)月內(nèi)接受過激素、抗組胺及免疫治療者；(2)合并有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能障礙等其他疾病。兩組患者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情并簽署同意書。

表1 兩組患者的一般資料比較

1.2 觀察指標(biāo)與檢測方法 (1)外周血單個(gè)核細(xì)胞的提?。悍謩e抽取兩組患者外周靜脈血4 mL進(jìn)行抗凝。PBMCs 通過密度梯度離心，分離的乳白色PBMCs層加入1 mL PBS稀釋得到BMCs懸液。(2)采用PT-PCR 檢測PBMC 中miR-146a 表達(dá)：①BMCs 總RNA的提取:將兩組患者的PBMCs懸液使用Trizol法提取總RNA后加入35 μL RNase-free水在60℃水浴下5～10 min，使用核酸紫外分析儀檢測RNA 濃度，保證OD260/280為1.8～2.0，電泳檢測RNA含量。②逆轉(zhuǎn)錄合成反應(yīng)體系：將兩組患者的PBMCs 中提取的總RNA 用RNase-free水稀釋至2 ng/μL的濃度。RNA模板2 μL，RT引物2 μL，5×RT緩沖液5 μL，dNTP(2.5 mm)2 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，20 U/μLRT 酶0.5 μL，ddH2O24 μL。以β-actin 為內(nèi)參基因，cDNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)系統(tǒng)：cDNA 2 μL，2×SYBR Green qPCR 混合物10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，焦碳酸二乙酯6 μL的二乙氧基碳酸氫鹽(DEPC)水，總反應(yīng)量20 μL，重復(fù)3 次，反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 min；60℃1 min；40 循 環(huán)，72℃30 s。 使 用qRT-PCR 儀擴(kuò)增操作，使用2-ΔΔCT方法計(jì)算miR-146a表達(dá)的相對(duì)表達(dá)。(3)Western blot檢測STAT5b表達(dá)：將蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物加入到RIPA 緩沖液中，按照蛋白質(zhì)提取程序提取PBMC 蛋白后，10%SDS-PAGE 電泳分離，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，PVDF 膜封閉后一抗孵育：抗-STAT5b 和抗GAPDH，洗膜，然后二抗孵育2 h，洗膜，顯影分析結(jié)果。GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。

1.3 鼻部癥狀評(píng)分[8]對(duì)流涕、噴嚏、鼻塞、眼癢和咽癢等癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，每項(xiàng)癥狀評(píng)分為0～3分，其中0分為無癥狀，1 分為癥狀較輕，2 分為癥狀明顯，且影響日?；顒?dòng)，3 分為癥狀嚴(yán)重，影響患者睡眠和日常活動(dòng)。各項(xiàng)評(píng)分之和，≤6 分為輕度，＞6 分為中重度患者。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料首先行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 分析miR-146a、STAT5b 相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分的相關(guān)性。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者PBMC 中的miR-146a、STAT5b 表達(dá)水平比較 觀察組患者PBMC 中的miR-146a 和STAT5b相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

表2 兩組患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

組別觀察組對(duì)照組t值 P值例數(shù)8780 miR-146a 2.15±0.983.65±1.00-9.7850.001 STAT5b 0.58±0.181.53±0.34-22.8190.001

2.2 不同臨床特征AR 患者的miR-146a 表達(dá)水平比較 觀察組中重度患者PBMC中miR-146a相對(duì)表達(dá)量明顯低于輕度患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而不同性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和變應(yīng)原患者PBMC 中的miR-146a 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表3 不同臨床特征AR患者的miR-146a表達(dá)水平比較(±s)

表3 不同臨床特征AR患者的miR-146a表達(dá)水平比較(±s)

臨床資料性別男女年齡(歲)≤30＞30體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)＜24≥24變應(yīng)原混合真菌其他病情程度輕度中重度例數(shù)50375829553253343948 miR-146a相對(duì)表達(dá)量2.18±0.952.11±0.992.13±0.912.19±0.872.11±0.942.22±0.982.16±0.912.13±0.872.41±0.971.94±0.92 t值0.334-0.294-0.5180.1532.313 P值0.7390.7690.6060.8790.023

2.3 不同臨床特征AR 患者的STAT5b 表達(dá)水平比較 觀察組中重度患者PBMC 中STAT5b 相對(duì)表達(dá)量明顯低于輕度患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而不同性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和變應(yīng)原患者PBMC 中STAT5b 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

表4 不同臨床特征AR患者的STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

表4 不同臨床特征AR患者的STAT5b表達(dá)水平比較(±s)

臨床資料性別男女年齡(歲)≤30＞30體質(zhì)量指數(shù)(kg/m2)＜24≥24變應(yīng)原混合真菌其他病情程度輕度中重度例數(shù)50375829553253343948 STAT5b相對(duì)表達(dá)量0.60±0.140.55±0.160.56±0.160.62±0.140.56±0.130.61±0.160.59±0.120.56±0.130.79±0.200.41±0.16 t值1.55-1.716-1.5871.1019.848 P值0.1250.0900.1160.2740.001

2.4 miR-146a、STAT5b 相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分的相關(guān)性 觀察組患者PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.544、-0.577，P＜0.05)，miR-146a 和STAT5b 呈正相關(guān)(r=0.645，P＜0.05)，見圖1。

圖1 miR-146a、STAT5b相對(duì)表達(dá)量與鼻部癥狀評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

變應(yīng)性鼻炎全球發(fā)病率較高，患者癥狀為持續(xù)性鼻癢、打噴嚏、流鼻涕等，是哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)因素[9-10]。變應(yīng)性鼻炎的治療方法主要是進(jìn)行過敏原特異性免疫療法來有效恢復(fù)人體免疫力，但該方法的治療時(shí)間較長，可能出現(xiàn)全身性超敏反應(yīng)[11-12]。隨著人們對(duì)變應(yīng)性鼻炎疾病認(rèn)識(shí)的加深，他們發(fā)現(xiàn)免疫失衡不足以解釋變應(yīng)性鼻炎炎癥反應(yīng)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)數(shù)量的變化或功能喪失在過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[14]。近年來，miRNA 的功能為AR發(fā)生機(jī)制和治療方法提供思路，其中miR-146 是Treg 細(xì)胞中表達(dá)量最高的miRNA 之一，其參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(ROCK1)，增加轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[15]。

JAK-STAT 與多種炎癥和自身免疫性疾病有關(guān)，受到激活時(shí)會(huì)發(fā)生酪氨酸磷酸化和二聚化，形成特殊的信號(hào)傳遞結(jié)構(gòu)，向細(xì)胞核傳遞細(xì)胞因子信號(hào)，參與免疫調(diào)節(jié)和免疫細(xì)胞的產(chǎn)生[16]。先前的實(shí)驗(yàn)表明，STAT5b 也在Treg 細(xì)胞中起著重要作用[17-18]。筆者認(rèn)為miR-146a通過調(diào)節(jié)STAT5b 來參與AR的發(fā)生和發(fā)展。STAT5a 和5b 亞型具有高度同源性，但STAT5b的敲除會(huì)使Treg 細(xì)胞的功能維持受影響，而STAT5a則不會(huì)引起對(duì)細(xì)胞的影響[19]，因此，本研究針對(duì)STAT5b進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。這與已有研究結(jié)果[20]一致，筆者猜測miR-146a調(diào)節(jié)STAT5b 的表達(dá)使Treg 分化，患者外周血Treg 細(xì)胞減少，影響患者免疫調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生。miR-146a和STAT5b表達(dá)水平與變應(yīng)性鼻炎的疾病活動(dòng)度有關(guān)。本研究中，觀察組中重度患者外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對(duì)表達(dá)量明顯低于 輕 度 患 者(P＜0.05)，進(jìn) 一 步 驗(yàn) 證miR-146a 和STAT5b 水平與患者病情密切相關(guān)。推測miR-146a可能通過調(diào)節(jié)STAT5b 信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能,參與外周血Treg 細(xì)胞的分化和功能維持在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用。

本研究通過相關(guān)性分析證明miR-146a 可以正向調(diào)控STAT5b的表達(dá)以影響Treg細(xì)胞的分化。然而，本研究不能證實(shí)miR-146a是否是級(jí)聯(lián)反應(yīng)中STAT5b的表達(dá)和激活所必需的，還需要進(jìn)一步對(duì)機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。

目前臨床中缺少外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 的表達(dá)水平與變應(yīng)性鼻炎病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系研究，本研究具有一定的創(chuàng)新性，證實(shí)在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過程中，免疫功能增強(qiáng)和炎性細(xì)胞因子激活起重要作用，STAT5b 可以調(diào)節(jié)外周血Treg 細(xì)胞的分化，為變應(yīng)性鼻炎的臨床治療提供新思路和新靶點(diǎn)，具有一定的研究價(jià)值。但本研究缺少相應(yīng)機(jī)制的研究，缺乏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持，存在一定的局限性，需要進(jìn)一步探究。

綜上所述，變應(yīng)性鼻炎患者外周血PBMC 中miR-146a 含量和STAT5b 表達(dá)水平下調(diào)，與患者病情程度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)兩者間存在正相關(guān)關(guān)系。