張雪，徐彬，劉又文，李無(wú)陰，張虹，岳辰

(1.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471002；2.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012)

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)屬中醫(yī)學(xué)“骨蝕”范疇[1]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腎虛、血瘀是ONFH的基本證候，而補(bǔ)腎活血法則是中醫(yī)治療ONFH最主要的治則之一[2]?；谘a(bǔ)腎活血法組方的股骨頭壞死愈膠囊是傳承兩百余年的平樂(lè)郭氏正骨治療“骨蝕”的經(jīng)典方劑。前期的臨床研究顯示，股骨頭壞死愈膠囊能有效改善ONFH患者的髖關(guān)節(jié)功能，延緩病情進(jìn)展[3]。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，該藥能夠提高激素性O(shè)NFH兔血清骨鈣素與降鈣素水平[4]。

股骨頭壞死愈膠囊的組成藥物較多，明確其治療ONFH的靶點(diǎn)及作用機(jī)制較為困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，根據(jù)成分、疾病、靶點(diǎn)之間相互作用的系統(tǒng)研究方法，通過(guò)高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，對(duì)生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，具有整體性、系統(tǒng)性等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物活性成分篩選、藥物作用機(jī)制及疾病發(fā)病機(jī)制研究等方面[5]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物有效成分及靶點(diǎn)篩選分別在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中醫(yī)藥百科全書(encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索股骨頭壞死愈膠囊主要組成藥物“鹿茸”“續(xù)斷”“杜仲”“丹參”“雞血藤”“黃芪”的活性成分(設(shè)定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18)和靶點(diǎn)。剔除重復(fù)活性成分和靶點(diǎn)后,在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中將靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為規(guī)范的基因名稱，并剔除無(wú)靶點(diǎn)活性成分。將從TCMSP與ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得的活性成分和靶點(diǎn)信息取并集，得到股骨頭壞死愈膠囊的有效成分和靶點(diǎn)信息。

1.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“osteonecrosis of femoral head”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得ONFH相關(guān)基因。同時(shí)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載包含ONFH基因數(shù)據(jù)的GSE74089數(shù)據(jù)集，通過(guò)R軟件Limma包進(jìn)行差異基因分析(篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05、logFC>1)得到ONFH差異表達(dá)基因。將上述ONFH相關(guān)基因、ONFH差異表達(dá)基因及1.1中獲得的藥物靶點(diǎn)基因輸入Venny2.1.0在線作圖網(wǎng)站繪制韋恩圖，將獲得的交集基因作為股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將1.1篩選出的有效成分和1.2篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因名稱輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(Version11.0)中進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件進(jìn)行分析，剔除孤立有效成分和孤立靶點(diǎn)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因功能及信號(hào)通路富集分析使用R軟件的ClusterProfiler包對(duì)1.2篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，挖掘關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和通路信息。

1.5 核心靶點(diǎn)篩選將1.2篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因名稱輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(Version11.0)構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件分析網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及度值，篩選其中具有最高度值的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 藥物有效成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果在TCMSP中篩選到活性成分121個(gè)、靶點(diǎn)243個(gè)，在ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到活性成分95個(gè)、靶點(diǎn)405個(gè)。將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到的活性成分和靶點(diǎn)分別取并集后獲得股骨頭壞死愈膠囊的有效成分203個(gè)(鹿茸有效成分2個(gè)、續(xù)斷有效成分6個(gè)、杜仲有效成分153個(gè)、丹參有效成分86個(gè)、雞血藤有效成分92個(gè)、黃芪有效成分134個(gè))，靶點(diǎn)592個(gè)。

2.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選結(jié)果在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到ONFH相關(guān)基因2033個(gè)，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE74089數(shù)據(jù)集獲得ONFH差異表達(dá)基因8178個(gè)(上調(diào)基因5061個(gè)、下調(diào)基因3117個(gè))(圖1)。將ONFH相關(guān)基因、ONFH差異表達(dá)基因及藥物靶點(diǎn)基因取交集后，獲得股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)57個(gè)(圖2)。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果構(gòu)建的藥物-成分-靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)路包含200個(gè)節(jié)點(diǎn)和500條邊，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示137個(gè)藥物有效成分與57個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)有對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖3)。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)基因功能及信號(hào)通路富集分析結(jié)果GO功能富集分析生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能目錄下前10位的富集分析結(jié)果見圖4，主要涉及激素反應(yīng)(類固醇激素、糖皮質(zhì)激素、肽激素及激素的分泌和運(yùn)輸)，氧供反應(yīng)(氧氣水平、缺氧和氧氣水平降低)，免疫系統(tǒng)過(guò)程調(diào)節(jié)(炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞遷移、T細(xì)胞活化及白細(xì)胞-細(xì)胞粘附調(diào)節(jié))，骨細(xì)胞調(diào)節(jié)(分化、骨化、穩(wěn)態(tài)、遷移)，骨小梁形成，骨重塑調(diào)節(jié)，骨化調(diào)節(jié)，軟骨發(fā)育，骨合成過(guò)程等。KEGG信號(hào)通路富集分析排名前10位的富集結(jié)果見圖5，主要包括缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路、鞘脂信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號(hào)通路。

2.5 核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果以篩選出的57個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)為具有最高度值的關(guān)鍵靶點(diǎn)，即核心靶點(diǎn)(圖6)。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為腎藏精，主骨生髓，為先天之本。骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育、盛衰強(qiáng)弱均與腎精充盈與否有關(guān)，腎精充盈則骨有所養(yǎng)、骨骼強(qiáng)健，腎精虧虛則骨失所養(yǎng)、髓不實(shí)而骨不堅(jiān)，因此腎精充盈是保證骨骼健康的重要條件。肝腎同源，肝藏血，腎水虧虛不能滋養(yǎng)肝木，又會(huì)形成血虛、血瘀，血液不能發(fā)揮其濡養(yǎng)作用，從而誘發(fā)骨蝕。因此，盡管歷代醫(yī)家對(duì)于骨蝕的辨證論治并不完全統(tǒng)一，但均認(rèn)為腎虛、血瘀是其基本證候，補(bǔ)腎活血法為其主要治則之一。股骨頭壞死愈膠囊中，鹿茸溫腎壯陽(yáng)，丹參活血化瘀，二者共為君藥；續(xù)斷、杜仲合用補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、行血脈、助鹿茸補(bǔ)腎壯骨兼活血，黃芪益氣行血，雞血藤行血補(bǔ)血，四藥共為臣藥。諸藥合用，共奏溫補(bǔ)腎陽(yáng)、活血祛瘀止痛之效。

圖1 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的股骨頭壞死差異表達(dá)基因火山圖和表達(dá)量熱圖

圖2 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選韋恩圖

關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的分子生物學(xué)機(jī)制主要涉及HIF-1、NF-κB、p53等信號(hào)通路，參與激素反應(yīng)、氧供反應(yīng)，免疫系統(tǒng)過(guò)程調(diào)節(jié)、骨細(xì)胞調(diào)節(jié)、骨小梁形成、骨重塑調(diào)節(jié)、骨化調(diào)節(jié)、軟骨發(fā)育、骨合成等生物學(xué)過(guò)程。已有研究表明，補(bǔ)腎活血藥物可通過(guò)HIF-1信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路，p53信號(hào)通路治療多種疾病，包括ONFH、骨關(guān)節(jié)炎及脊柱退變[6]。HIF-1α是恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧濃度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)干細(xì)胞血管生成中起關(guān)鍵作用[7]，也被證實(shí)參與了早期ONFH的發(fā)生發(fā)展[8]。HIF-1α信號(hào)通路被證實(shí)參與骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的形態(tài)和功能調(diào)節(jié)[9]。Wu等[10]發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可以促進(jìn)家兔股骨頭組織中HIF-1α及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而延緩ONFH。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，通過(guò)參與細(xì)胞因子釋放，與許多骨科疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系[11]。Qu等[12]在ONFH患者的變性軟骨和經(jīng)卵泡抑素樣蛋白1處理的軟骨細(xì)胞中檢測(cè)到NF-κB信號(hào)通路激活。Pei等[13]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4/NF-κB的過(guò)度激活可能交互式地抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路并誘發(fā)ONFH，并提出NF-κB可以作為ONFH的治療靶點(diǎn)。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)p53，而抑制p53表達(dá)可以顯著增強(qiáng)線粒體自噬，抵抗骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡和衰老，并有效提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)早期激素誘導(dǎo)的ONFH的修復(fù)作用。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認(rèn)為股骨頭壞死愈膠囊的有效成分通過(guò)57個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與氧供反應(yīng)、激素反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、骨代謝等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)而對(duì)ONFH發(fā)揮治療作用。

圖3 構(gòu)建的藥物-成分-靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點(diǎn)基因GO功能富集分析結(jié)果氣泡圖

圖5 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點(diǎn)基因KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果氣泡圖

圖6 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

篩選出的57個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，TNF是具有最高度值的核心靶點(diǎn)。作為重要的炎癥因子，TNF與成骨細(xì)胞分化、成熟密切相關(guān)[15-16]，參與ONFH的發(fā)生發(fā)展[17-18]。Li等[19]的研究表明，在ONFH患者的軟骨退變過(guò)程中，TNF通過(guò)NF-κB信號(hào)通路上調(diào)了解聚蛋白樣金屬蛋白酶-7的表達(dá)，而后者可使軟骨退變加重。Peng等[20]的研究表明，移植堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞和異種抗原-松質(zhì)骨，可以抑制TNF表達(dá)，促進(jìn)ONFH的修復(fù)。Qu等[12]發(fā)現(xiàn)，卵泡抑素樣蛋白1在ONFH患者關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織中表達(dá)增加，并且可以增加ONFH模型中TNF的表達(dá)。

本研究的結(jié)果顯示，股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的潛在靶點(diǎn)為TNF，其作用機(jī)制可能為通過(guò)HIF-1、NF-κB、p53等信號(hào)通路，參與激素反應(yīng)、氧供反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程調(diào)節(jié)及骨形成調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程。