張?chǎng)谓?陳羽璇 戴愛(ài)玲 楊小燕

摘要：豬細(xì)小病毒（PPV）是臨床上造成母豬繁殖障礙的重要致病原，4/6/7型豬細(xì)小病毒是近幾年發(fā)現(xiàn)的新型豬細(xì)小病毒，并且均已在流產(chǎn)胎兒中發(fā)現(xiàn)。為了解福建地區(qū)三種豬細(xì)小病毒的感染情況，本研究收集2020年福建地區(qū)68份發(fā)病豬血清和20份發(fā)病豬組織樣品進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PPV4、PPV6、PPV7在福建地區(qū)存在較高的感染率分別為9.09%、12.50%、37.50%。PPV4與PPV6之間存在著較高的共感染率，為5.68%，分別占PPV4、PPV6陽(yáng)性樣品的62.50%及45.45%。另外，本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)PPV4、PPV6血清樣品的檢出率均低于組織樣品，而PPV7在血清樣品的檢出率高于組織樣品。本研究初步調(diào)查了2020年福建地區(qū)4/6/7型豬細(xì)小病毒的感染情況，為未來(lái)新型豬細(xì)小病毒的防控提供數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞：PPV4;PPV6;PPV7;病原檢測(cè)

豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）是一種單股線性無(wú)囊膜DNA病毒，全基因組大小為4～6.3kb[1]。臨床上能夠引起母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎以及母豬的反復(fù)發(fā)情，是全球范圍內(nèi)造豬繁殖障礙的主要致病原之一，為生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

1965年，PPV1于德國(guó)的細(xì)胞培養(yǎng)污染物中首次被分離到[3]。但隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的新型豬細(xì)小病毒被發(fā)現(xiàn)（PPV2～PPV7）。2008年，PPV4首次發(fā)現(xiàn)于我國(guó)香港，并且與PCV2具有較高的共感染率，可能與PMWS有關(guān)[4，5]。2014年，Ni等[6]從流產(chǎn)胎兒的組織樣品中鑒定出PPV6，并且該組織樣品中不包含其他可能造成豬繁殖障礙的致病原，包括PRV、PRRSV、PPV1、PCV2、CSFV、SIV和布魯氏桿菌。該調(diào)查表明PPV6可能是造成母豬繁殖障礙的又一重要致病原。2016年，Palinski等[7]首次在美國(guó)健康成年豬的肛拭子中發(fā)現(xiàn)PPV7，隨后在中國(guó)、波蘭、韓國(guó)、瑞典和巴西等多個(gè)國(guó)家均能發(fā)現(xiàn)PPV7的存在。2018年韓國(guó)，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在流產(chǎn)胎兒組織中PPV7的檢出率高達(dá)24.0%，表示其可能與母豬繁殖障礙有關(guān)[8]。但目前對(duì)于新型細(xì)小病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)較為困難，對(duì)其致病性研究的手段較為有限，但仍要加強(qiáng)對(duì)新型細(xì)小病毒的監(jiān)測(cè)。

目前，由于PPV1滅活或減毒疫苗的廣泛使用，PPV1得到有效防控。而新型豬細(xì)小病毒的大范圍流行提示PPV1疫苗很難針對(duì)其產(chǎn)生交叉保護(hù)作用。另一方面，福建地區(qū)對(duì)于新型細(xì)小病毒流行的研究較為空白。因此本研究采集2020年來(lái)自福建地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)發(fā)病豬的血清、組織對(duì)4/6/7型豬細(xì)小病毒進(jìn)行檢測(cè)，旨在了解福建地區(qū)4/6/7型豬細(xì)小病毒的流行情況，并為當(dāng)?shù)匦滦拓i細(xì)小病毒的防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源與處理

樣品均為2020年于福建地區(qū)采集的發(fā)病豬血液（68份）、組織（20份）。所有樣品采集后均由龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所置于-80℃保存。

1.2 試劑與引物合成

病毒DNA/RNA共提取試劑盒購(gòu)自青島英賽特生物科技有限公司;2×Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;用于檢測(cè)PPV4/6/7的引物分別根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.3 PCR檢測(cè)

應(yīng)用PCR方法對(duì)PPV4/6/7進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix、8.5μL ddH2O、2μL引物對(duì)、2μL DNA。PCR反應(yīng)條件分別如下：95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)包括95℃變性30s，60℃/58℃/65℃退火30s，72℃延伸30s，共設(shè)置35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

對(duì)88份樣品檢測(cè)結(jié)果顯示PPV4陽(yáng)性率為9.09%，血液中陽(yáng)性率為5.88%，組織中陽(yáng)性率為20.00%;PPV6陽(yáng)性率為12.50%，血液中陽(yáng)性率為10.29%，組織中陽(yáng)性率為20.00%;PPV7陽(yáng)性率最高，為37.50%，血液中陽(yáng)性率為44.12%，組織中陽(yáng)性率為15.00%。PPV4和PPV6共感染率為5.68%，分別占PPV4、PPV6陽(yáng)性樣品的62.50%及45.45%;PPV4和PPV7共感染率為4.55%，分別占PPV4、PPV7陽(yáng)性樣品的50.00%及12.12%;PPV6和PPV7共感染率為4.55%，分別占PPV6、PPV7陽(yáng)性樣品的36.36%及12.12%。PPV4、PPV6、PPV7的共感染率為3.41%。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1和2。

3 討論

上述三種新型細(xì)小病毒均已在世界范圍內(nèi)流行。2006—2011年，黃律等[11]對(duì)我國(guó)14個(gè)省份共計(jì)931份樣品進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)2006—2008年均未發(fā)現(xiàn)PPV4的流行，而從2009—2011年P(guān)PV4的感染率大幅上升，部分省市甚至達(dá)到50%以上感染率。2020年，汪偉等[12]對(duì)我國(guó)廣西135份豬血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPV6感染率為18.5%，而25份PPV6陽(yáng)性樣品中，與PCV2共感染率達(dá)到24.0%。Wang等[13]對(duì)廣西2015—2017年385份豬血清進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)PPV7感染率為27.3%，PCV2感染率為36.4%，而PPV7與PCV2的共感染率達(dá)到17.4%。孫久萌[14]對(duì)我國(guó)PPV1-7感染的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，在1990—2017年來(lái)自我國(guó)30個(gè)省市的437份樣品中58.1%的臨床樣品至少存在一種PPV感染，其中PPV4、PPV6、PPV7的感染率分別為11.4%、31.1%、13.5%，而三種病毒的最早檢測(cè)出的樣品時(shí)間為1994、1999和1997年。上述研究表明三種新型豬細(xì)小病毒在我國(guó)早已形成較為廣泛的感染，并且與PCV2擁有較高的共感染率，可能是臨床上PCVAD潛在的致病因子。本研究發(fā)現(xiàn)PPV4、PPV6、PPV7在福建地區(qū)存在較高的感染率，分別為9.09%、12.50%、37.50%。并且PPV4與PPV6存在著較高的共感染率，兩種病毒似乎存在著某種機(jī)制能夠相互刺激其復(fù)制。PPV4與PPV6在組織中的檢出率均高于血清中的檢出率，但PPV7在血清中的檢出率高于組織中檢出率，而造成這種現(xiàn)象的原因還有待研究。

由于病毒分離的困難，目前對(duì)于新型豬細(xì)小病毒的致病性研究仍無(wú)法完全證明其致病性。PPV4、PPV6、PPV7是目前均已在流產(chǎn)胎兒中發(fā)現(xiàn)的新型豬細(xì)小病毒，目前雖無(wú)法證明三種新型豬細(xì)小病毒對(duì)母豬繁殖障礙的影響。但鑒于PPV1的教訓(xùn)，加強(qiáng)對(duì)新型豬細(xì)小病毒的監(jiān)測(cè)及防控才是明智之舉。

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