陳 陽，高 健，朱 平，高洪軍，婁翼來，王義東

（1.天津師范大學 天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387；2.天津師范大學 地理與環(huán)境科學學院，天津 300387；3.吉林省農業(yè)科學院 農業(yè)資源與環(huán)境研究所，長春 130033；4.中國農業(yè)科學院 農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

土壤有機質（soil organic matter，SOM）是土壤質量的關鍵屬性，在土壤肥力、生產力、生物多樣性、可持續(xù)發(fā)展和氣候變化等方面起著重要作用[1].目前，針對SOM的研究主要集中在數(shù)量方面，對其化學成分的認識還較為薄弱[1].SOM的化學成分主要包括脂肪族化合物、芳香族化合物、木質素、酚類化合物、多糖類化合物以及含氮化合物[2]，這些化合物成分是SOM發(fā)揮功能的基礎，因此探討SOM的化學成分特征變化具有重要意義[1-2].SOM的組分和結構復雜，存在高度異質性[3]，即不同組分的理化性質和周轉穩(wěn)定存在顯著差異.物理分組是探究SOM化學成分變化的重要方法，包括密度分組、粒級分組和團聚體分組.相比于化學分組，物理分組對土壤的化學性質破壞性較小，能更好地保護有機質特性.Six等[4]提出的團聚體分組技術已被廣泛應用于SOM的研究中.粒級分組能夠有效地反映有機質的賦存狀態(tài)和腐解程度，因為顆粒態(tài)組分（particulate organic matter，POM）和礦質結合組分（mineral-associated organic matter，MAOM）是通過特定過程形成的，具有不同的持久性和功能性[5].顆粒態(tài)組分主要包含未分解或半分解的動植物殘體，其碳氮比（C/N）一般為10~40，易被微生物分解利用；而礦質結合組分是SOM分解較徹底且與土壤礦質相結合的部分，主要來自微生物殘體，其C/N通常為8~13[6-7]，難被微生物進一步利用，因此表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性和較長的滯留時間[8].顆粒態(tài)組分可以進一步分級為粗顆粒組分（coarse particulate organic matter，cPOM：>250μm）和細顆粒組分（fine particulate organic matter，f POM：53~250μm）[9].有機培肥是農業(yè)生產中一項重要的管理措施，長期有機培肥（有機肥施用、秸桿還田）會影響SOM的含量、元素組成和化學成分[10-13]，但如何影響SOM的粒級分異及化學特征尚不清楚，亟需深入研究.

黑土是我國寶貴的高肥力土壤資源，本課題組借助東北黑土長期定位實驗，基于粒級分組，利用元素分析儀和熱裂解-氣相色譜/質譜技術（Py-GC/MS）研究有機培肥對SOM粒級分異和化學特征的影響.假設：①相比于有機培肥，粒級主要調控著SOM的碳、氮組成和化學成分特征，因為不同粒級往往表征著SOM的不同腐解程度；②秸稈還田和有機肥施用對SOM的碳、氮組成和化學成分具有不同的影響，因為二者在底物質量上差異明顯.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

公主嶺黑土長期施肥試驗地位于吉林省公主嶺的國家黑土肥力和肥料效益長期定位實驗基地（43°30′23″N，124°48′34″E），屬溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫5.6℃，年降水量450~600 mm，年蒸發(fā)量1 200~1 600 mm.全年無霜期為144 d，每年日照時間約為2 330 h.該區(qū)土壤母質為第四紀黃土狀沉積物，屬于黑土土類黑土亞類肥黑土土種.田間耕作方式為玉米連作或者玉米-大豆輪作，一年一熟，且為雨養(yǎng)農業(yè)，常規(guī)操作.

初始耕層土壤性質：pH值為7.6、土壤有機碳（SOC）13.23 g/kg、總氮（TN）1.4 g/kg、總磷（TP）1.39 g/kg、總鉀（TK）22.1 g/kg、堿解氮114 mg/kg、速效磷27 mg/kg、速效鉀190 mg/kg.

1.2 實驗設計與樣品采集

實驗開始于1990年，共設置12種實驗處理，本研究選取其中3種處理：施加氮肥+磷肥+鉀肥（NPK—單施化肥）、NPK+秸稈（NPKS—秸稈還田）、NPK+豬糞（NPKM—有機肥施用）.所施用的化肥量分別為：氮肥16.5 kg/hm2、磷肥82.5 kg/hm2、鉀肥82.5 kg/hm2.有機肥豬糞作底肥，施用量為23 000 kg/hm2，1/3氮肥、磷肥和鉀肥作口肥，而其余2/3氮肥于拔節(jié)前追施于表土下10 cm處.秸稈還田即將每季作物秸稈的一半還田，不考慮其養(yǎng)分.2017年秋收后，在每個小區(qū)內采用“S”型取樣法隨機選擇5個點，使用螺旋鉆采集取樣點處0~20 cm深度的土壤，均勻混合成一個樣品后裝入自封袋中，編號并密封，每種處理重復取樣3次.將樣品帶回實驗室，去除雜質（如動植物殘基、礫石等），在室溫下風干，過2 mm篩后保存?zhèn)溆?

1.3 土壤有機質粒級分組

參照文獻[4，13]的改良方法，用濕篩法分離土壤的3個粒級（cPOM：>250μm，fPOM：53~250μm，MAOM：<53μm）.具體操作方法為：稱取土壤樣品25 g，置于100 mL塑料瓶中，加入25顆玻璃珠（直徑4 mm），60 mL超純水，將塑料瓶置于振蕩器上，在180 r/min轉速下振蕩1 h（25℃），之后將土樣混合液用250μm的篩網(wǎng)篩分，用超純水沖洗篩上部分至流下的水澄清.將篩上殘留部分收集至鋁盒中，在60℃下烘干至恒重，得到粗顆粒組分.將篩下部分物質用超純水沖洗到大鋁盒中，在60℃條件下烘干至恒重，之后將土樣轉移至100 mL塑料瓶內，加入60 mL六偏磷酸鈉溶液（5 g/L）和25顆玻璃珠，將塑料瓶置于振蕩器上，在180 r/min轉速下振蕩18 h（25℃）.振蕩完成后將塑料瓶中土樣混合液用53μm的篩網(wǎng)篩分，用超純水沖洗篩上部分至流下的水澄清，將篩上和篩下部分分別轉移到鋁盒中，在60℃下烘干至恒重.篩上部分為細顆粒組分，篩下部分為礦質結合組分.冷卻后，對3部分樣品分別進行稱重，將土壤樣品研磨并通過100目的土壤篩，留存?zhèn)溆?

1.4 樣品分析與測試

利用元素分析儀（PerkinElmer 2400Ⅱ，美國）測定全土與各粒級組分中SOC和TN的含量，C/N為SOC和TN含量的比值.利用雙擊式裂解器（PY-2020iD，F(xiàn)rontier Laboratories Ltd，日本）與聯(lián)用的QP2010氣相色譜-質譜儀（GC/MS，QP-2010Ultra，日本）對樣品進行化學成分測定.取5 mg充分研磨后的土樣置于白金小舟中，以自由落體方式將樣品投入到石英裂解管中（裂解溫度550℃）.裂解結束后，將化合物轉入氣相色譜儀（界面溫度為300℃）.實驗采用DB-5型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，F(xiàn)rontier Laboratories Ltd，日本），分流進樣比為100∶1（載氣為He，流速為0.8 mL/min）.升溫順序為：初始溫度為40℃，保持3 min，然后以10℃/min的速率升至260℃后，再以15°C/min的速率升至300℃，保持5 min.質譜條件采用電子轟擊離子源（EI）模式，電子能量為70 eV，接口溫度為300℃，全掃描模式，質荷比（m/z）的掃描范圍為29~500.參照國家標準與技術研究所（NIST）化合物數(shù)據(jù)庫（2011版）、已發(fā)布的光譜標準和實際標準，采用歸一化法計算峰面積，從而對熱裂解產物進行分析鑒定.共鑒定出了332種化學成分，根據(jù)化學結構和相似性分析分為10組[14-15]：脂肪族化合物、單環(huán)芳香烴、多環(huán)芳香烴、木質素、酚類化合物、多糖、氨基酸氮、雜環(huán)氮、其他含氮化合物和其他化合物.熱裂解過程中，氨基酸氮易轉化為常見的腈、吲哚、咪唑、吡咯、吡啶、吡嗪[15]，因此將這6種含氨基氮的化合物組合在一起，以減少分類誤差.其他化合物包括含有鹵素原子（Br、I、Cl）的化合物和具有更復雜分子結構的化合物.

所有熱裂解化合物分為3種來源：植物來源、微生物來源和多重來源（植物+微生物）[16].長鏈脂質（>18個C原子）、木質素、酚類化合物、多糖、氨基酸氮（吲哚類）和雜環(huán)氮（嗪類）主要歸為植物來源；短鏈脂質（<16個C原子）、芳香族化合物、氨基酸氮（吡咯、吡啶、腈）和其他含氮化合物被歸為微生物來源；而一些脂類（16~18個C原子）和其他化合物歸為多重來源化合物[14-16].

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的Tukey多重比較和對應分析檢驗不同施肥處理以及不同粒級組分下物質間的差異性（P<0.05）.用SPSS 26進行方差分析和對應分析，用Origin 2018進行繪圖.

2 結果

2.1 不同粒級土壤有機質質量占比特征

不同施肥條件下不同粒級土壤有機質質量占比特征如圖1所示.

圖1 不同施肥條件下不同粒級土壤有機質質量占比特征Fig.1 Mass distribution of the different particle size classes under different fertilization regimes

土壤各粒級組分的質量占比特征為：礦質結合組分（>80%）>粗顆粒組分（7%~9%）>細顆粒組分（6%~7%），礦質結合組分的質量占比顯著高于粗顆粒組分和細顆粒組分的質量占比（P<0.05）.有機肥施用使細顆粒組分質量占比提高了19.7%，使礦質結合組分質量占比降低了4.1%；秸稈還田對不同粒級土壤組分無顯著影響.

2.2 不同粒級土壤有機質的碳氮含量與碳氮比

不同粒級土壤中有機碳和總氮的含量以及碳氮比如圖2所示.

圖2 土壤有機碳和總氮的含量以及碳氮比在全土和不同粒級組分中的分布Fig.2 Pools of SOC and TN content，and C/N ratio in the bulk soil and different particle size classes

經(jīng)過27 a的實驗，與單施化肥相比，秸稈還田、有機肥施用分別使全土中SOC含量提高了19%和65%，礦質結合組分中SOC含量最高，與顆粒態(tài)組分中SOC含量的差異具有統(tǒng)計學意義.有機肥施用使粗顆粒、細顆粒、礦質結合組分的SOC含量分別提升了162%、174%、40%（圖2（a））.對于TN而言，秸稈還田和有機肥施用分別使全土中TN的含量顯著提升了92%和96%.各個粒級組分TN含量與SOC含量的變化趨勢一致，礦質結合組分中TN的含量遠超過其他兩種組分中的含量.添加秸稈未改變顆粒態(tài)組分的TN含量，但使礦質結合組分中TN的含量顯著提升98%；有機肥的添加使粗顆粒組分、細顆粒組分、礦質結合組分的TN含量分別提升244%、302%和77%（圖2（b））.秸稈還田顯著降低了全土中的C/N，約降低38%.同一施肥方式下C/N隨著粒級的減小呈現(xiàn)出降低的趨勢，顆粒態(tài)有機質的C/N顯著高于礦質結合組分的C/N.秸稈還田和有機肥施用均使得各個顆粒組分的C/N降低約13%~40%（圖2（c））.

2.3 不同粒級土壤有機質組分化學特征

不同粒級土壤中有機質組分的化學成分也有所不同，成分及分析如圖3和圖4所示.

圖3 土壤有機質化學成分Fig.3 Chemical composition of soil organic matter

顆粒態(tài)組分主要富集脂肪族化合物、單環(huán)芳香烴、酚類化合物和多糖，其中，細顆粒組分的脂肪族化合物和單環(huán)芳香烴相對豐度分別比礦質結合組分高出20%和25%，而礦質結合組分主要富集含氮化合物，相對豐度占比超過75%.與單施化肥相比，有機肥施用使全土中木質素和酚類化合物的相對豐度分別提高了174%和58%，秸稈還田使全土中酚類化合物相對豐度增加了129%.有機肥施用使粗顆粒組分中氨基酸氮的相對豐度降低了49%，細顆粒組分中脂肪族化合物的相對豐度降低了37%，礦質結合組分中多環(huán)芳香烴的相對豐度降低92%，但細顆粒中的木質素和多糖相對豐度分別提升了1 188%和23%.秸稈還田幾乎未對各粒級土壤化學組成產生顯著影響.由圖4可知，以維度1原點為界，礦質結合組分分布在左側，而顆粒態(tài)組分主要分布在右側；多環(huán)芳香烴、含氮化合物和其他化合物富集在左側，脂肪族化合物、單環(huán)芳香烴、木質素、酚類化合物和多糖富集在右側，表明化學成分存在明顯的粒級分異.

圖4 土壤有機質化學成分（相對豐度）對應分析Fig.4 Correspondence analysis of the chemical composition（relative abundance）of soil organic matter

2.4 不同粒級土壤有機質來源分析

不同粒級土壤有機質來源也有所不同，如圖5和圖6所示.植物來源化合物在粗顆粒和細顆粒中相對富集，相對豐度達到20%~45%；而在礦質結合組分中，微生物來源化合物相對富集，相對豐度達到55%~72%.全土中植物來源化合物約占17%~20%，微生物來源占56%~70%，不同施肥方式對化合物來源的影響不大.但添加有機肥料后，礦質結合組分中植物來源化合物為13%~20%，顯著低于其他2個組分（P<0.05）.秸稈還田和有機肥施用使細顆粒的植物來源化合物分別增加了76%和91%，微生物來源化合物均減少了約20%，多重來源化合物分別減少了47%和82%.由圖6可知，以維度1原點為界，礦質結合組分主要分布在左側，而顆粒態(tài)組分主要分布在右側；多重來源化合物富集在左側，植物來源化合物富集在右側，而微生物來源化合物處于中間位置，表明有機質來源存在粒級分異，但分異較小.

圖5 土壤有機質來源Fig.5 Sources of soil organic matter

圖6 土壤有機質來源（相對豐度）對應分析Fig.6 Correspondence analysis of sources（relative abundance）of soil organic matter

3 討論與結論

3.1 不同粒級土壤有機碳、總氮含量和C/N對長期有機培肥的響應

本研究顯示，長期不同施肥條件下，黑土中礦質結合組分質量占比均最大（>80%），顯著高于其他2個組分.大部分SOC和TN集中在礦質結合組分中，主要是由于礦質結合組分在農業(yè)用地土壤中所占比例很高[5-6，9]，周轉速率慢，有利于SOC和TN的穩(wěn)定與固存[17]，進而更能被微生物持續(xù)性利用，這支持了前文第一個假設.SOM結構復雜，能夠對不同的施肥處理方式迅速響應，從而改變土壤的理化性質[18].就有機培肥而言，有機肥施用提升了粗顆粒組分和細顆粒組分的質量占比，降低了礦質結合組分的質量占比，且細顆粒組分和礦質結合組分受有機肥施用處理影響顯著，這與以往的研究結果類似.因此，長期施用有機肥會增加作物生物量（地上部分和地下根系）和根系代謝產物，促進新鮮有機質的輸入，從而促進小粒級組分向大粒級組分膠結[19].秸稈還田沒有顯著增加SOC的含量，可能是因為秸稈還田量以及還田年限的限制[12].2種有機培肥處理均顯著增加了全土和各個粒級組分中TN的含量.

SOC和TN的變化使得粗顆粒組分和細顆粒組分具有較高的C/N，而礦質結合組分的C/N最低，這與粗顆粒組分和細顆粒組分中植物來源化合物較多的結果相符.此外，有機物肥料的添加可使C/N降低，而C/N越低，表明有機質的腐解程度越高.對此提出2個解釋：①POM部分受到團聚體的保護[9]，因此分解程度低；②隨著秸稈還田和有機肥施用的投入，土壤中微生物活動及其代謝作用增強，有足夠的氮來進行消耗，而同化同質量的氮需要消耗更多的碳，從而反作用于土壤的C/N[20].

3.2 不同粒級土壤有機質化學組成對長期有機培肥的響應

相比于礦質結合組分，粗顆粒組分和細顆粒組分可富集更多的脂肪族化合物、單環(huán)芳香烴、木質素、酚類化合物和多糖[21-22].POM組分選擇性地保留了具有頑固性特點的植物來源化合物，以實現(xiàn)短期的持久性運轉，盡管長期以來，物理保護是這些物質長期留存的主要原因[7，23].另外，部分細顆粒組分可能被微團聚體封閉[12]，保留芳香族化合物和木質素.而礦質結合組分中含氮化合物的相對豐度很高[7]，這也表明了它積累了許多微生物殘體[7，15]，它們很容易被黏土礦物吸附，形成有機質礦物結合體，從而增加這些礦質結合組分在土壤中的貯存時間[2，24].基于單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)SOM的化學成分主要在粒級方面產生分異，這支持了第一個假設.但本研究結果也再次表明，細顆粒組分并不是3種粒級組分的過渡部分，這可能歸因于：①與沙粒相關的有機質向粗顆粒組分偏移；②微團聚體對細顆粒組分有物理保護[9].

全土中，有機培肥主要影響的是木質素和酚類化合物的含量.對各個粒級組分主要影響為：粗顆粒組分中氨基酸氮減少；細顆粒組分中脂肪族化合物減少，木質素和多糖增多；礦質結合組分中多環(huán)芳香族化合物減少.由于木質素類化合物和多糖類化合物是由植物殘體（細胞壁）衍生而來，其中部分產物在動物消化和微生物代謝中得以保留[25]，這可以解釋在有機培肥作用下，細顆粒組分中這些物質相對增加，這一結論也支持了第二個假設，微團聚體對細顆粒組分的物理保護為這一結果做出了進一步解釋[9].但是與單施化肥相比，粗顆粒組分的氨基酸氮隨著有機肥施用而減少，這可能與含氮物質被利用有關.而在全土以及其他2個組分中，含氮化合物的相對豐度幾乎不受施肥條件的影響，因為這些含氮化合物主要來自微生物，從而促成了其穩(wěn)定的來源[14-16].

微生物來源的化合物對SOM的總體貢獻率為55%~70%，這與以往的研究結果類似[16].本研究顯示，礦質結合組分中植物來源化合物降低，微生物來源相應增加，木質素和多糖含量的降低也直接造成了這一結果.含氮化合物以氨基酸氮為主，其主要來源為微生物，有研究表明微生物來源的化合物能夠穩(wěn)定在土壤礦物表面[14]，這也印證了本研究的結果.SOM的穩(wěn)定性和周轉速率取決于其分子的化學組成特征[26]，但是在添加有機肥后，除細顆粒組分的化合物中植物來源增多以及微生物和多重來源減少外，全土和其他2個組分并未對來源組成做出響應.

4 結論

本研究以東北黑土長期有機培肥為研究平臺，研究了不同粒級土壤有機質的碳、氮含量和化學組成特征，結論如下：

（1）各粒級組分中，礦質結合組分質量占比最大，且主導著SOC、TN庫.秸稈還田增加了TN的含量，而有機肥施用增加了SOC和TN含量.

（2）有機培肥后顆粒態(tài)組分中脂肪族化合物、芳香族化合物、木質素、酚類化合物和多糖相對豐度增加.礦質結合組分中含氮化合物，特別是氨基酸氮相對豐度增加.有機培肥后礦質結合組分的化學組成變化小，表明該部分的SOM化學特征比較穩(wěn)定.SOM的來源組成在粒級間變化不明顯，但2種有機培肥均改變了細顆粒SOM的來源.

綜上，粒級組分主要調控著SOM的含量與元素組成、化合物組成特征，而有機培肥的影響相對較小.