劉童童，盧晨曦，原楚妍，陳 怡，吳 弘

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

纖維素是一種廉價且分布廣泛的多糖物質，是世界上最豐富的可再生資源.纖維素分解菌可高效、安全、無污染地將纖維素轉化為葡萄糖、乙醇等產品，既可以解決環(huán)境污染，也可以緩解能源危機及浪費等問題[1].細菌纖維素分解菌的發(fā)掘及基因組學研究是高效利用纖維素的關鍵環(huán)節(jié)，在已研究的眾多菌株篩選來源中，食草動物由于食性與纖維素的關系密切，其消化道和糞便等都成為篩選纖維素降解細菌的重要菌種來源[2-4].雖然通過不同途徑獲得了一些可以降解纖維素的菌株，但很多菌株的酶活低、環(huán)境適應性差，因此，分離和篩選可工業(yè)化生產的菌株仍然是纖維素分解利用的重要研究方向.纖維素降解菌的高值化利用也是纖維素研究領域的一個熱點課題，其中，利用纖維素降解菌生產聚羥基丁酸酯（PHB）是新的研究方向.PHB可以在微生物體內積累，具有與傳統(tǒng)塑料相似的力學性質，還具有獨特的生物降解性，有助于解決“白色污染”問題[5].在微生物體內，共有3個酶參與PHB合成：β-酮基硫解酶（PhaA）、依賴I-DPH的乙酰乙酰輔酶A還原酶（PhaB）和PHA合成酶（PhaC）[6].研究人員將羅氏真養(yǎng)菌（Ralstonia eutropha）中PHB代謝途徑的3個基因phaA、phaB、phaC克隆出來，將其整合到1個質粒上并提高質粒穩(wěn)定性，構建能夠以葡萄糖為底物合成PHB的重組菌[7].葡萄糖價格偏高，如果發(fā)掘出能夠以纖維素為底物的菌株合成PHB，將有助于提高菌株的高值化開發(fā)，促進可降解塑料的推廣.

小熊貓（Ailurus fulgens）以富含纖維素的竹子為食物，體內存在有助于消化纖維素的微生物，因此可以作為篩選纖維素降解菌的研究對象，從其糞便中發(fā)掘產纖維素酶的菌株[8].本研究從小熊貓糞便中篩選出能夠高效分解纖維素的菌株，結合形態(tài)學觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析方法，對菌株進行鑒定.以來自羅氏真養(yǎng)菌（Ralstonia eutropha）的基因為模板，將PHB合成途徑中的基因phaA、phaB和phaC轉入到菌株中，得到重組菌株.以玉米秸稈為碳源進行重組菌株合成PHB的發(fā)酵實驗，用響應面分析確定重組菌株生物合成PHB的最優(yōu)條件，包括溫度、培養(yǎng)起始pH值、搖床轉速等.本研究一方面拓展了已有的可分解纖維素的菌種資源庫；另一方面，能夠為利用廉價碳源生物合成PHB提供實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣品來源于天津市動物園，對小熊貓飲食及健康狀況進行篩選后，獲得新鮮的小熊貓糞便.

1.2 主要儀器與試劑

儀器：GC-2014C型氣象色譜儀，日本島津公司；Hitachi HF5000型透射電鏡，日本日立公司.

試劑：DNA聚合酶，美國NEB公司；蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉等，中國醫(yī)藥集團有限公司；3HB標準品，北京藍晶微生物科技有限公司.引物和測序工作由華大基因完成.

1.3 實驗方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

選取小熊貓糞便樣品的中間部分，稱取10 g，將其放入含有90 mL無菌水的錐形瓶中，連續(xù)搖動20 min，搖晃充分以制備菌懸液，隨后進行平板篩選以獲得單一菌落.

1.3.2 菌株篩選

將富集培養(yǎng)的單一菌液涂布在羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）初篩培養(yǎng)基上，待菌落生長至適宜大小后，用1%的剛果紅染色20 min，用濃度為1 mol/L的NaCI溶液徹底沖洗去染料，觀察透明圈是否有變化.選取培養(yǎng)基上較完整的菌落進行測量，記錄透明圈直徑D和菌落直徑d，計算比值D/d.對實驗樣本進行橫向比較，篩選比值較大的實驗對象[9].

1.3.3 纖維素酶（CMCase）活力測定（DNS法）

菌株接種入發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣，留上清液作為粗酶液.以1 mg/mL葡萄糖標準溶液作為底物，測定OD540值，繪制標準曲線，具體原理參考文獻[9-10].

1.3.4 濾紙分解實驗

取多條大小相同的濾紙條于錐形瓶中，將菌液滴加到以濾紙條為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中（菌液應沒過濾紙條，使之充分分解），空白對照組為不接種菌株的培養(yǎng)液.搖床連續(xù)培養(yǎng)后記錄，確定濾紙分解情況[10].

1.3.5 菌株的鑒定

細菌在含有CMC-Na的培養(yǎng)基中生長一段時間后，觀察并記錄菌落的形狀、大小、透明度、顏色、質地等.采用革蘭氏染色法，借助顯微鏡觀察細菌的大小、結構，記錄其形態(tài)和染色特征.菌株的生理生化性質描述參考《伯杰細菌鑒定手冊》[11].挑取單菌落進行培養(yǎng)后，以細菌基因組DNA為模板，采用細菌通用引物進行基因擴增：上游引物16S（F）為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物16S（R）為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.擴增后進行序列分析[10，12].

1.3.6 PHB合成途徑構建及檢測

以來自羅氏真養(yǎng)菌的基因為模板，將PHB合成途徑中的基因phaA、phaB和phaC構建在表達質粒pBBR1-mcs1中，得到重組質粒3hb.隨后將該重組質粒轉入到篩選出來的菌株中，合成了一條從碳源到PHB的代謝途徑.

以玉米秸稈為碳源進行菌株合成PHB的發(fā)酵實驗.在不同發(fā)酵階段取樣，測定發(fā)酵液的干重和其中PHB的含量.取菌液，離心富集后用去離子水反復洗滌以得到較干凈的菌體，采用氣相色譜法（GC）分析菌體中的PHB含量.以3HB標準品為標樣，先將標準品和待測品一起進行酯化，隨后進行氣相色譜分析，采用內標法準確計算出菌體中PHB的質量分數（%）[13].利用透射電鏡觀察PHB顆粒在菌株中的分布情況.首先在菌液中加入戊二醛固定細菌，然后進行預處理，制備切片，鍍膜進行觀察.

1.3.7 響應面曲線分析

基于Box-Behnken Design（BBD）原理進行實驗設計，影響細菌生長的因素包括培養(yǎng)溫度（A）、初始pH值（B）和搖床轉速（C），將其設置為高、中、低3個水平（1，0，-1）.通過Design Expert 8.0進行擬合，再利用方差分析和顯著性分析確定優(yōu)化模型在本實驗中的可靠性.比較計算得出理論最優(yōu)產量，進一步驗證培養(yǎng)條件優(yōu)化的準確性[14].

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

利用剛果紅染色法從小熊貓糞便中初篩得到5株菌.首先測定透明圈直徑，隨后以CMCase酶活為指標進行復篩.繪制得到的葡萄糖標準曲線方程：y=0.669 5 x+0.020 5（R2=0.999 8），其中x為葡萄糖的質量，y為540 nm處的OD值.利用該方法測定初篩得到的5株菌，其透明圈直徑、CMCase酶活等如表1所示.

表1 篩選菌株的D/d值與CMCase酶活Tab.1 D/d values and CMCase enzyme activity ofscreened strains

由表1可知，N8菌株的D/d值為4.21，測定的CMCase酶活為16.35 U/mL，遠大于其他菌株的酶活性，表現出較高的產纖維素酶的能力.

N8菌株的菌落形態(tài)特征如圖1（a）所示，在培養(yǎng)基上，N8菌株的菌落扁平，呈不透明狀，顏色為灰白色無光澤，表面粗糙不光滑，邊緣不規(guī)則，質地為蠟狀.對N8菌株進行生理生化檢測，結果顯示：革蘭氏染色、芽孢染色、V-P實驗均為陽性；硫化氫、甲基紅、吲哚實驗結果均為陰性；待測菌株可利用葡萄糖、淀粉和羧甲基纖維素鈉，不能利用蔗糖.對N8菌株進行DNA提取，利用16S rDNA進行PCR擴增后得到1.5 kb的片段，如圖1（b）所示.對PCR結果進行測序后，在NCBI進行BLAST比對，利用MEGA7.0進行多重序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹.結合N8菌株形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA分子鑒定結果發(fā)現，N8菌株近緣物種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），相似度高達99%，因此初步認定篩選出的是一株芽孢桿菌，命名為Bacillus subtilis-N8.

圖1 N8菌株的剛果紅染色和16S rDNA PCRFig.1 Results of Congo red staining and 16S rDNA of Strain N8

對初篩得到的5株菌進行濾紙條降解實驗，結果顯示，5株菌中N8菌株對濾紙條的降解效果最好.在實驗開始后的第8天，濾紙條出現結構崩解現象，培養(yǎng)基從澄清狀態(tài)變得稍顯渾濁.在實驗開始后的第12天，培養(yǎng)基中濾紙條邊緣潰爛，濾紙條由一整片分解為3塊面積不等的碎片，結構明顯崩解，培養(yǎng)基中出現濾紙條崩解后的碎屑，培養(yǎng)基渾濁情況加劇.在實驗開始的第15天，濾紙條完全降解為碎屑狀態(tài)，培養(yǎng)基狀態(tài)較濾紙條崩解的初期出現絮狀物質.實驗結束時，培養(yǎng)基顏色變深，渾濁程度繼續(xù)加劇，濾紙條徹底降解完畢，全部為碎屑狀態(tài)，無明顯塊狀.

2.2 構建可合成PHB的重組菌株

配制以葡萄糖、大麥秸稈、玉米秸稈等為單一碳源的產酶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)后通過測定CMCase酶活來檢測利用效率，結果如圖2所示.由圖2可以看出，以玉米秸稈為單一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基產酶活力最高，且價格低廉，可作為N8菌株的最佳碳源.

圖2 不同碳源下N8菌株產纖維素酶的活性Fig.2 CMCase activity produced by strain N8 using different carbon sources

構建可合成PHB的重組質粒3hb，隨后將該質粒轉入到N8菌株中，得到重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb），培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，以玉米秸稈為碳源，觀測菌體內PHB的積累情況.結果發(fā)現，培養(yǎng)一段時間后，重組菌株體內開始積累PHB，如圖3所示.

圖3 重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）中PHB的合成Fig.3 Synthesis of PHB in recombination strain Bacillus subtilis-N8（3hb）

2.3 PHB的合成及響應面法優(yōu)化培養(yǎng)條件

選取菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）發(fā)酵條件中的溫度、培養(yǎng)起始pH值、搖床轉速3個因素作為響應面法的研究對象，設計各因素水平如表2所示.用軟件Design Expert 8.0進行設計，以PHB產量作為實驗的衡量指標，17組實驗的結果如表3所示.

表2 BBD實驗設計因素水平表Tab.2 BBD experimental design factor level

表3 BBD實驗設計及實驗結果Tab.3 BBD experimental design and experimental results

根據實驗結果，用軟件Design Expert 8.0進行分析，得出回歸線方程：

PHB產量（g/L）=14.30-1.40A+0.41B-0.21C+0.35AB-0.45AC+0.12BC-4.09A2-2.21B2-0.61C2

2.3.1 方差分析

進一步通過方差分析來確定模型擬合度是否顯著以及單一因素和每2個因素間的相互作用是否顯著，結果如表4所示.在分析過程中，P<0.05表示相關性具有統(tǒng)計學意義.根據BBD實驗結果進行分析，實驗所得回歸擬合度P值為0.002 9，小于0.05，該模型回歸顯著性好，說明重組菌中PHB的產量與設置的實驗因素之間存在明顯的回歸關系.失擬值P值為0.195 7，大于0.05，說明模型的失擬不顯著.此外，該模型的實驗系數為0.929 2，表明回歸方程求得的PHB產量預測值的可信度為92.92%.對P值的分析表明，溫度因素對PHB產量影響顯著，培養(yǎng)起始pH值和搖床轉速對PHB產量的影響不顯著.而相互作用分析發(fā)現：AB、AC、BC相互作用不顯著；A2、B2二次項作用顯著，C2二次項作用不顯著.

表4 BBD實驗結果分析Tab.4 Analysis of BBD experimental results

2.3.2 響應面3D圖與平面等高線

利用Design-Expert，以2個因素間的交互作用繪制出響應面圖和等高線圖，響應面曲面上凸，說明有最大響應值以及最適的變量；等高線為橢圓形，說明2個因素的交互作用顯著.溫度與培養(yǎng)起始pH值的交互作用響應面圖和等高線圖如圖4所示.從圖4可以看出，當搖床轉速固定不變，溫度在35.0~37.5℃區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在6~7區(qū)間時，PHB產量隨二者的升高而升高，呈正相關.當溫度在37.5~40.0℃區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在7~8區(qū)間時，PHB產量隨二者的升高而降低，呈負相關.

圖4 溫度與培養(yǎng)起始pH值的交互作用響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour map of the interaction between temperature and initial pH

溫度與搖床轉速的交互作用響應面圖和等高線圖如圖5所示.

圖5 溫度與搖床轉速的交互作用響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the interaction between temperature and shaking speed

從圖5可以看出，當培養(yǎng)起始pH值固定不變，溫度在35.0~37.5℃區(qū)間、搖床轉速在100~150 r/min區(qū)間時，PHB產量隨二者的升高而升高，呈正相關.當溫度在37.5~40.0℃區(qū)間、搖床轉速在150~200 r/min區(qū)間時，PHB產量隨二者的升高而降低，呈負相關.

搖床轉速與培養(yǎng)起始pH值的交互作用響應面圖和等高線圖如圖6所示.

圖6 培養(yǎng)起始pH值與搖床轉速的交互作用響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the interaction between the initial pH and shaking speed

從圖6可以看出，當溫度固定不變，搖床轉速在100~150 r/min區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在6~7區(qū)間時，PHB產量隨二者的升高而升高，呈正相關.當搖床轉速在150~200 r/min區(qū)間、培養(yǎng)起始pH值在7~8區(qū)間時，PHB產量隨二者的升高而降低，呈負相關.

對響應面模型進行求導分析，結果顯示，溫度為37.09℃、培養(yǎng)起始pH值為7.08、搖床轉速為144.72 r/min的情況下，PHB的產量最高，預計達到14.44 g/L.為了檢驗響應面法的可行性，用得到的最優(yōu)條件對菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）進行液體發(fā)酵驗證，最終PHB產量為15.98 g/L，與預測值14.44 g/L較為接近，說明此響應面模型可信.因此，通過響應面法對重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）進行發(fā)酵條件優(yōu)化是可行的.

3 討論與結論

本研究采用剛果紅染色法從小熊貓的糞便中篩選出具有纖維素降解能力的菌株，根據染色形成的透明圈大小初步判斷細菌降解纖維素的能力，復篩時測定纖維素酶活力并進行濾紙分解實驗，最后結合形態(tài)學觀察、生理生化特征和16S rDNA序列測定，發(fā)現該菌株與Bacillus subtilis相似度高達99%，因此確認菌株為Bacillus subtilis-N8.以來自羅氏真養(yǎng)菌的基因為模板，將PHB合成途徑中的基因phaA、phaB和phaC轉入到N8菌株中，得到可以合成聚羥基丁酸酯（PHB）的重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）.有研究證明微生物以半纖維素水解物為碳源可以生產PHB.如Yu等[15]利用蔗渣水解液生產PHB，其產量可占干細胞質量的57%.Dietrich等[16]利用半纖維素水解物和木質纖維素降解產物作為碳源進行PHB生產，最高產量為5.72 g/L.半纖維素水解物常常會帶有抑制細胞生長的物質，因此需要進行脫毒處理或高接種量來克服抑制作用，以維持細菌生長.本研究篩選出的能夠利用玉米秸稈為碳源生產PHB的菌株，因無需對纖維素水解液進行脫毒處理，可大大降低PHB的合成成本.

為了進一步探索重組菌株Bacillus subtilis-N8（3hb）的最適發(fā)酵條件，利用響應面法，選取溫度、培養(yǎng)起始pH值和搖床轉速3個因素作為研究對象，優(yōu)化發(fā)酵條件，結果顯示在溫度37.09℃、培養(yǎng)起始pH值為7.08、搖床轉速為144.72 r/min的培養(yǎng)條件下，菌株具有最高的PHB產量（15.98 g/L），遠超過Dietrich等[16]的研究中PHB的產量.本研究發(fā)現的新菌株為纖維素的開發(fā)和利用提供了良好的菌種資源，也為利用纖維素等廉價碳源合成高附加值的PHB材料提供了新途徑.