王 蕊，李 剛，修偉明，王麗麗，趙建寧

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191）

據(jù)ISAA最新報(bào)告指出，目前全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積已達(dá)到了25億hm2，從轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來(lái)約增長(zhǎng)了113倍[1].隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷增加，其種植對(duì)環(huán)境安全的影響也受到社會(huì)各界的關(guān)注.土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)最大的碳庫(kù)，是碳循環(huán)的重要組成部分[2].生物固碳可提高生態(tài)系統(tǒng)的碳固定及存儲(chǔ)[3]，是公認(rèn)的經(jīng)濟(jì)環(huán)保的固碳方式[4].目前發(fā)現(xiàn)了7條生物固碳途徑[5]，其中，卡爾文循環(huán)是自然界中最主要的生物固碳途徑[6]，亦是調(diào)控大氣CO2濃度的主要途徑，參與各個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的CO2固定和有機(jī)化合物的合成[3].1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RubisCO）是卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶，根據(jù)分子生物學(xué)方法并且按照結(jié)構(gòu)、催化型和對(duì)O2的敏感性，RubisCO可分為4類(lèi)（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）[6].RubisCOⅠ主要存在于能進(jìn)行光合作用的有機(jī)體內(nèi)，RubisCOⅠ大亞基編碼的cbbL基因承擔(dān)了全部的催化功能并具有高度保守性，經(jīng)常作為固碳微生物的標(biāo)記物[6].

轉(zhuǎn)基因玉米是全世界種植最多的4種轉(zhuǎn)基因作物之一.目前，已在非靶標(biāo)生物、土壤動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)、土壤細(xì)菌和真菌群落多樣性等方面[7-9]對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行了研究.本課題組已針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)土壤古菌[10]和固氮細(xì)菌[11]群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)土壤古菌和固氮細(xì)菌的豐度、群落多樣性和組成均無(wú)顯著影響.本研究以攜帶有抗蟲(chóng)基因cry1Ab和耐除草劑基因epsps的轉(zhuǎn)基因玉米C0030.3.5為研究對(duì)象，利用qPCR和T-RFLP技術(shù)，探究該轉(zhuǎn)基因玉米的種植對(duì)土壤固碳微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響，以期從多方面、多角度為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米的環(huán)境安全性提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)地位于吉林省四平市伊通滿族自治縣民主村（北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司吉林省實(shí)驗(yàn)示范基地），北緯43°15′，東經(jīng)125°20′.氣候類(lèi)型為中溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，多年平均降水量為627.8 mm，全年平均氣溫為4.6℃，無(wú)霜期138 d.供試土壤類(lèi)型為白漿土[12].實(shí)驗(yàn)地基本情況見(jiàn)文獻(xiàn)[12]報(bào)道.

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供的親本非轉(zhuǎn)基因玉米（DBN318）（PM）、攜帶有抗蟲(chóng)基因cry1Ab和耐除草劑基因epsps的轉(zhuǎn)基因玉米（C0030.3.5）（TM）.實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)玉米品種分別選取3個(gè)10 m×15 m的小區(qū)（即3次重復(fù)）.樣地具體情況見(jiàn)文獻(xiàn)[12]報(bào)道.

1.2 土壤樣品采集

分別于玉米生長(zhǎng)的拔節(jié)期（2016年7月6日，J）、抽雄期（2016年7月27日，T）、乳熟期（2016年8月24日，M）和完熟期（2016年9月27日，R），采用十字交叉法采集土壤樣品.將同一生長(zhǎng)時(shí)期同一小區(qū)的土壤樣品混勻分成2份，一份用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)，另一份用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（-70℃冰箱保存）.具體采集方法及樣品處理參照文獻(xiàn)[10].

1.3 分析方法

測(cè)定土壤理化性質(zhì)：土壤pH值、水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13].使用流動(dòng)分析儀（AA3-HR，德國(guó)Seal公司）測(cè)定土壤全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量.

提取土壤總DNA：使用PowerSoilTMTotal DNA Isolation試劑盒（美國(guó)Mo Bio Laboratories）對(duì)0.25 g土壤樣品（-70℃冰箱保存）提取土壤總DNA.具體操作步驟參照文獻(xiàn)[10].

定量PCR分析：使用qPCR引物對(duì)k2f（ACCAYCAAGCCSAAGCTSGG）和v2r（GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC），測(cè)定土壤固碳細(xì)菌的cbbL基因豐度.反應(yīng)程序和體系參照文獻(xiàn)[14].所有樣品和無(wú)模板對(duì)照均設(shè)置3次重復(fù).本研究擴(kuò)增效率為88.2%，R2等于1.000.

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析：利用T-RFLP技術(shù)測(cè)定土壤固碳細(xì)菌cbbL基因的多樣性，所用引物對(duì)k2f和v2r同上.用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system試劑盒（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行擴(kuò)增，將得到的3次純化產(chǎn)物混勻，酶切（HhaⅠ、MspⅠ）后送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序分析.按照文獻(xiàn)[15]中的方法，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行計(jì)算處理，獲得末端限制性片段（terminal-restriction fragment，T-RF）的相對(duì)豐度（Ra）數(shù)據(jù)，Ra>1%的T-RFs納入后續(xù)分析，Ra>10%的T-RFs定為優(yōu)勢(shì)種群.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0中的單因素方差分析法（Duncan法）進(jìn)行多組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析.采用Origin 9.1進(jìn)行繪圖.采用Canoco for windows 4.5.1進(jìn)行軟件RDA分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

2個(gè)玉米品種所在樣地的土壤理化性質(zhì)如表1所示.由表1可以看出，玉米的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中，同一生長(zhǎng)時(shí)期PM和TM樣地土壤的理化性質(zhì)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.在不同生長(zhǎng)時(shí)期，同一玉米品種所在樣地的土壤理化性質(zhì)存在差異.對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米分析表明：土壤pH值和全氮含量在乳熟期和完熟期顯著高于拔節(jié)期和抽雄期的數(shù)值（P<0.05）；土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在抽雄期和完熟期顯著高于拔節(jié)期和乳熟期的數(shù)值（P<0.05）；土壤有機(jī)質(zhì)含量在完熟期顯著高于拔節(jié)期和抽雄期的數(shù)值（P<0.05）；土壤的全磷和硝態(tài)氮含量在拔節(jié)期顯著高于其他3個(gè)時(shí)期的數(shù)值（P<0.05）；土壤銨態(tài)氮含量在乳熟期顯著高于抽雄期和完熟期的數(shù)值（P<0.05）.對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米分析表明：土壤pH值和有機(jī)質(zhì)含量在乳熟期和完熟期顯著高于拔節(jié)期和抽雄期的數(shù)值（P<0.05）；土壤中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在抽雄期最高（P<0.05）；土壤全氮含量在完熟期顯著高于拔節(jié)期（P<0.05）；土壤銨態(tài)氮含量在乳熟期最高（P<0.05）；土壤硝態(tài)氮含量在拔節(jié)期最高（P<0.05）；土壤速效磷含量在完熟期最低（P<0.05）.

表1 2個(gè)玉米品種所在樣地的土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical properties of soil in sample sites of two maize varieties

2.2 土壤固碳細(xì)菌的cbbL基因豐度

2個(gè)玉米品種土壤固碳細(xì)菌的cbbL基因豐度如圖1所示.每克土壤中，PM和TM土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度的范圍分別為5.62×108~9.02×108copies和5.83×108~7.47×108copies.PM在拔節(jié)期、抽雄期和乳熟期的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度大于TM的數(shù)值，在完熟期略低于TM的數(shù)值，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.隨著生長(zhǎng)時(shí)期的推進(jìn)，PM和TM所在樣地的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度均呈先升高后降低的趨勢(shì)，在乳熟期達(dá)到最大值，但不同生長(zhǎng)時(shí)期的豐度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.

圖1 2個(gè)玉米品種的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度Fig.1 Abundance of the soil cbbL gene in two maize varieties

2.3 土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度與土壤性質(zhì)的關(guān)系

對(duì)土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示.由表2可以看出，土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）.

表2 土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficients for relation between cbbL gene abundance and physical and chemical properties of soil

2.4 土壤固碳細(xì)菌群落的T-RFLP分析

玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期土壤固碳細(xì)菌cbbL基因的TRFs相對(duì)豐度如圖2所示.

圖2 2個(gè)玉米品種的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因T-RFs相對(duì)豐度Fig.2 Average relative abundance of T-RFs of the soil cbbL gene in two maize varieties

從PM和TM不同生長(zhǎng)時(shí)期的土壤中共獲得25種不同長(zhǎng)度的T-RFs.其中，26（7.46%~25.88%）、41（7.71%~20.46%）、57（13.26%~41.31%）和125 bp（5.14%~11.53%）片段所代表的物種為所有土壤中的優(yōu)勢(shì)種群.玉米的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中，同一生長(zhǎng)時(shí)期PM和TM的優(yōu)勢(shì)片段的相對(duì)豐度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.除TM在抽雄期118 bp片段的相對(duì)豐度、在乳熟期10 bp片段的相對(duì)豐度以及34 bp片段的相對(duì)豐度顯著高于PM的數(shù)值外（P<0.05），PM和TM的其余片段在同一生長(zhǎng)時(shí)期的相對(duì)豐度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意度（P>0.05）.

在不同生長(zhǎng)時(shí)期，PM的26 bp片段相對(duì)豐度在拔節(jié)期最高（22.54%），在完熟期最低（12.05%）；41 bp片段相對(duì)豐度在乳熟期最高（20.46%），在完熟期最低（7.71%）；57 bp片段相對(duì)豐度在抽雄期最高（41.31%），在乳熟期最低（21.75%）；125 bp片段相對(duì)豐度在完熟期最高（11.07%），在抽雄期最低（5.14%）.TM的26 bp片段相對(duì)豐度在抽雄期最高（25.88%），在完熟期最低（7.46%）；41 bp片段相對(duì)豐度在乳熟期最高（13.67%），在完熟期最低（7.81%）；57 bp片段相對(duì)豐度在完熟期最高（39.36%），在拔節(jié)期最低（13.26%）；125 bp片段相對(duì)豐度在乳熟期最高（11.53%），在拔節(jié)期最低（5.45%）.

2.5 土壤固碳細(xì)菌cbbL基因多樣性指數(shù)的比較

根據(jù)T-RFLP酶切片段的種類(lèi)和豐度計(jì)算土壤固碳細(xì)菌的多樣性指數(shù)，從物種豐富度（Shannon指數(shù)）和均一性（Evenness指數(shù)）2個(gè)方面反映土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，結(jié)果如表3所示.由表3可以看出，玉米的4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期中，同一生長(zhǎng)時(shí)期PM和TM的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因的Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.隨著生長(zhǎng)時(shí)期的變化，PM的Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)均表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，TM的Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)均表現(xiàn)為降低的趨勢(shì).在拔節(jié)期，PM的Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)均顯著高于乳熟期的數(shù)值（P<0.05），TM的Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)均顯著高于完熟期的數(shù)值（P<0.05）.

表3 2個(gè)玉米品種的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因的多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity index of soil cbbL gene in twomaize varieties

2.6 土壤固碳細(xì)菌群落與環(huán)境因子的RDA分析

選取土壤固碳細(xì)菌群落的T-RFLP結(jié)果和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行RDA分析，結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，前2個(gè)排序軸總共可解釋cbbL基因多樣性變化的28.8%，土壤pH值（P=0.002）、硝態(tài)氮含量（P=0.004）和有機(jī)質(zhì)含量（P=0.046）與固碳細(xì)菌群落組成顯著相關(guān).拔節(jié)期PM和TM的土壤固碳細(xì)菌均分布在第4象限內(nèi)，其余3個(gè)時(shí)期PM和TM的土壤固碳細(xì)菌分布在其他3個(gè)象限內(nèi)，說(shuō)明玉米拔節(jié)期與其他3個(gè)時(shí)期的土壤固碳細(xì)菌的結(jié)構(gòu)差異明顯.

圖3 2個(gè)玉米品種的土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的RDA分析Fig.3 RDA analysis of soil carbon sequestrating bacterial in two maize varieties

3 討論與結(jié)論

本研究分析了種植抗蟲(chóng)-耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米（C0030.3.5）對(duì)土壤固碳細(xì)菌基因豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響.由qPCR分析可以看出，在同一生長(zhǎng)時(shí)期非轉(zhuǎn)基因玉米PM和轉(zhuǎn)基因玉米TM的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.隨著生長(zhǎng)時(shí)期的變化，PM和TM的土壤固碳cbbL基因豐度均呈先升高后降低的趨勢(shì)，均在乳熟期最高，但不同時(shí)期的差異不具有統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05）.相關(guān)分析結(jié)果表明，土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）.微生物合成體細(xì)胞需要一定數(shù)量的碳和氮，碳源由固碳細(xì)菌固定CO2提供，而氮源由土壤提供，土壤有效養(yǎng)分硝態(tài)氮的含量變化對(duì)固碳細(xì)菌有顯著影響[16].通常認(rèn)為，土壤pH值下降、土壤營(yíng)養(yǎng)元素和有機(jī)質(zhì)含量增高可為微生物提供能源，有利于微生物生長(zhǎng)[17].然而本研究分析發(fā)現(xiàn)，固碳微生物的豐度與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與劉茗等[18]研究闊葉林土壤固碳微生物、蘇鑫等[19]研究鹽堿土壤固碳微生物的結(jié)果相同.土壤自養(yǎng)細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化和人類(lèi)活動(dòng)，如種植模式、灌溉、土地利用和耕作等非常敏感[20].本研究中固碳細(xì)菌豐度與有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)楸狙芯康耐寥李?lèi)型為白漿土且進(jìn)行了耕作和種植，從而引發(fā)固碳細(xì)菌豐度的變化，具體原因還需進(jìn)一步研究.土壤pH值也會(huì)間接影響土壤有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分釋放，導(dǎo)致對(duì)生境變化較敏感的微生物種群豐度發(fā)生變化[21].

由T-RFLP分析數(shù)據(jù)可以看出，雖然PM和TM在各個(gè)時(shí)期不同長(zhǎng)度的T-RFs所占比例存在差異，但是土壤cbbL基因優(yōu)勢(shì)種群均為26、41、57和125 bp片段所代表的種群，說(shuō)明土壤固碳細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群結(jié)構(gòu)組成未發(fā)生變化.從多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)）可以看出，同一生長(zhǎng)時(shí)期的PM和TM玉米，其所在樣地土壤固碳細(xì)菌cbbL基因的群落結(jié)構(gòu)多樣性之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）.隨著生長(zhǎng)時(shí)期的推進(jìn)，PM的多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為先降低后升高趨勢(shì)，TM的多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，PM和TM不同生長(zhǎng)時(shí)期的土壤固碳細(xì)菌cbbL基因的群落結(jié)構(gòu)多樣性存在差異.RDA綜合分析結(jié)果表明，土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受土壤pH值、硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量3個(gè)因子的調(diào)控[19].土壤固碳細(xì)菌群落在不同生長(zhǎng)時(shí)期發(fā)生明顯分離.土壤pH值被認(rèn)為是決定土壤碳固定的主要因素[22].土壤硝態(tài)氮含量與固碳細(xì)菌群落組成顯著相關(guān)，這與禹飛[23]的研究結(jié)果一致.土壤固碳細(xì)菌是一類(lèi)主要利用CO2為碳源的自養(yǎng)生物，還可利用有機(jī)物作為碳源和能源，有機(jī)物分解產(chǎn)生的CO2亦可為其提供底物[20].玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期的土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分發(fā)生改變，可影響微生物的代謝活動(dòng)，進(jìn)而導(dǎo)致固碳微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[6].

總的來(lái)看，種植抗蟲(chóng)-耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米（C0030.3.5）對(duì)土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度和多樣性的影響不顯著.玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米樣地的土壤理化性質(zhì)、土壤固碳細(xì)菌cbbL基因豐度和多樣性均發(fā)生變化，土壤的pH值、硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量是驅(qū)動(dòng)土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)鍵因子.