王真真 李煒靜

1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，河北石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液內(nèi)科，河北石家莊 050011

急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的研究在近年來飛速進(jìn)展，但大多數(shù)患者仍很難通過現(xiàn)有的治療方法痊愈，目前新的治療方案正在研究之中。CD33 是一種67 kD 的1 型跨膜唾液酸糖蛋白，屬于免疫應(yīng)答的免疫球蛋白超家族成員。80%以上的AML 原始細(xì)胞均表達(dá)CD33[1-2]，其作為一種AML治療靶點(diǎn)，其在臨床上具有重要意義。奧佐米星（Gemtuzumab Ozogamicin，GO）是一種由人源化IgG4抗CD33單克隆抗體（hP67.6），與細(xì)胞毒蛋白-1 的衍生物結(jié)合而成的免疫結(jié)合物[3]，用于治療復(fù)發(fā)型和難治型AML，其以抗CD33 抗體（hP67.6）為載體，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。在臨床前模型中，GO 能夠殺死CD33 陽(yáng)性的白血病細(xì)胞[4]，因此其已被批準(zhǔn)用于治療65 歲以上復(fù)發(fā)性難治性AML[5]。然而GO 的細(xì)胞毒性作用與細(xì)胞表面CD33 表達(dá)量的關(guān)系及作用機(jī)制目前尚少見研究[6]。因此，本研究的主要目的是研究GO 介導(dǎo)的細(xì)胞毒性與CD33 表達(dá)量之間的關(guān)系及相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

選取細(xì)胞表面CD33 水平較低的人髓系OCIAML3 和KG-1a 細(xì)胞，用含有25 mmol/L N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸、10%熱滅活胎牛血清、1 mmol丙酮酸鈉和非必需氨基酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。OCI-AML3 和KG-1a 細(xì)胞購(gòu)于ATCC 細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司（貨號(hào)：12999145）；慢病毒（A35347，A35827）購(gòu)于賽默飛公司；MTT 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Sigma（貨號(hào)：M5672-1G）；Anti-Bcl-2（ab182858）、Anti-Caspase-3（ab202068）、Anti-Cleaved caspase-3（ab184787）購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

采用含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白和CD33 過表達(dá)的質(zhì)粒載體的慢病毒進(jìn)行OCI-AML3 和KG-1a 細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)過夜，將2×105個(gè)/ml 的懸浮細(xì)胞中加入聚凝胺，配成6 μg/ml 的混合液，加入不同梯度濃度的慢病毒，充分混勻。37℃孵育，4 h 后，加入等體積新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d。通過流式細(xì)胞術(shù)分析增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)情況來鑒別慢病毒轉(zhuǎn)染效率。通過流式細(xì)胞儀分選增強(qiáng)綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，并重新培養(yǎng)以進(jìn)行進(jìn)一步分析。根據(jù)CD33 表達(dá)量將細(xì)胞分為CD33 高表達(dá)組和CD33 低表達(dá)組。

1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96 孔板中，于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，采用15 μg/L濃度的GO 處理細(xì)胞[7]，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl 的5 mg/ml MTT 溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4 h；除去96 孔板中的所有培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜，在搖床上避光振搖過夜，檢測(cè)各孔的OD 值。

1.4 凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)

分別采用0、5、10 和15 μg/L 濃度的GO 處 理OCI-AML3 細(xì)胞，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×106個(gè)/孔接種于6 孔板，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵育；收集細(xì)胞，采用RIPA 裂解液提取細(xì)胞蛋白，電泳分離提取的蛋白；將蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜，洗膜，脫脂奶粉封閉40 min，洗膜；加入抗體Bcl-2、caspase 3、cleaved caspase 3 和β-Actin，4℃孵育過夜；洗膜后加入抗鼠IgG，室溫孵育，置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光。以β-Actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞表面CD33 表達(dá)水平比較

轉(zhuǎn)染后，OCI-AML3 和KG-1a 細(xì)胞表面CD33 表達(dá)水平均高于轉(zhuǎn)染前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

2.2 GO 對(duì)CD33 高表達(dá)組和CD33 低表達(dá)組細(xì)胞存活率的影響

相同濃度的GO 處理后，CD33 高表達(dá)組的OCIAML3 和KG-1a 細(xì)胞存活率均低于CD33 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 奧佐米星對(duì)CD33 高表達(dá)組和CD33 低表達(dá)組細(xì)胞存活率的影響（%，）

表1 奧佐米星對(duì)CD33 高表達(dá)組和CD33 低表達(dá)組細(xì)胞存活率的影響（%，）

2.3 不同濃度GO 處理OCI-AML3 細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白水平比較

GO 濃 度 為5、10、15 μg/L 時(shí)，OCI-AML3 細(xì) 胞Bcl-2 水平低于GO 濃度為0 時(shí)，cleaved-caspase 3、caspase 3 水平均高于GO 濃度為0 時(shí)；GO 濃度為10、15 μg/L 時(shí)OCI-AML3 細(xì)胞Bcl-2 水平低于GO 濃度為5 μg/L 時(shí)，cleaved-caspase 3、caspase 3 水平均高于GO 濃度為5 μg/L 時(shí)；GO 濃度為15 μg/L 時(shí)，OCIAML3 細(xì)胞Bcl-2 水平低于GO 濃度為10 μg/L 時(shí)，cleaved-caspase 3、caspase 3 水平均高于GO 濃度為10 μg/L 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

3 討論

復(fù)發(fā)和/或難治性AML 患者常表現(xiàn)為多重耐藥，盡管相關(guān)研究在近年來取得了飛速進(jìn)展[8-10]，但大多數(shù)患者仍不能通過現(xiàn)有的治療方法痊愈。而Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明[11-15]，對(duì)復(fù)發(fā)和/或難治性AML 患者進(jìn)行特異性抗體靶向化療可能獲得包括完全緩解在內(nèi)的臨床效果。當(dāng)將GO 作為單一藥物用于復(fù)發(fā)的老年AML 患者時(shí)，中位總生存期約為6 個(gè)月，能顯著改善AML 患者預(yù)后[16-19]。GO 在中國(guó)人群中的應(yīng)用尚未可知，本研究就GO 與CD33 的關(guān)系及作用機(jī)制進(jìn)行了分析。

研究表明，對(duì)CD33 高表達(dá)的人髓系細(xì)胞，GO 的細(xì)胞毒性更強(qiáng)[20-21]。GO 敏感性與細(xì)胞表面CD33 表達(dá)水平直接相關(guān)。在國(guó)外一些Ⅱ期臨床試驗(yàn)中[12,22-24]，對(duì)CD33 表達(dá)水平高的患者GO 的臨床療效往往越好。本研究結(jié)果提示，調(diào)整AML 細(xì)胞CD33 的表達(dá)水平可能是提高臨床療效的新方法。因此，GO 在AML 的治療中可能具有廣大的應(yīng)用前景[25]。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物發(fā)揮作用的一種重要的通路。本研究結(jié)果提示，GO 能誘導(dǎo)OCI-AML3細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍准按龠M(jìn)凋亡的蛋白家族成員在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示，GO 上調(diào)了細(xì)胞cleaved-caspase 3 和caspase 3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，提示GO 可以有效地促進(jìn)AML 細(xì)胞的凋亡。