白延寧，曹紹華，黃劍林，師文濤

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安 716000）

格列喹酮是一種臨床上廣泛使用的第二代磺酰脲類口服降血糖藥物。格列喹酮口服易吸收，主要通過肝臟代謝（發(fā)生羥基化和甲基化反應(yīng)），代謝產(chǎn)物大部分通過膽汁和糞便排出，僅有少部分（約5%）通過腎臟排出[1]。是現(xiàn)有的磺脲類口服降血糖藥中唯一不受腎功能影響的藥物，故常用于腎功能受損的糖尿病患者[2]，已被多個臨床指南推薦為治療糖尿病腎病的一線用藥[3]。

阿司匹林（又稱乙酰水楊酸）是臨床應(yīng)用最廣泛的血小板聚集抑制藥，是預(yù)防心血管事件的基礎(chǔ)用藥[4]。研究[5]顯示，心血管疾病和糖尿病相互關(guān)聯(lián)，糖尿病是心血管疾病的一個高危因素，而心血管疾病又是糖尿病患者死亡的主要原因之一。因此，預(yù)防心血管疾病是糖尿病患者重要的治療目標(biāo)之一，臨床上常將格列喹酮和阿司匹林聯(lián)合用于治療糖尿病及其并發(fā)癥。但是，目前二者聯(lián)合用藥后的藥動學(xué)影響研究尚未見報道。因此，本研究將從藥動學(xué)角度探討不同劑量的阿司匹林和格列喹酮聯(lián)合用藥后對格列喹酮在大鼠體內(nèi)的藥物效應(yīng)動力學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性 Sprague Dawley（SD)大鼠，體重 250～300 g，清潔級，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心[許可證號：SCXK（陜）2017-003]。

1.2 藥品與試劑

阿司匹林泡騰片（阿斯利康制藥有限公司，批號1602134，規(guī)格：0.5 g）；格列喹酮片（北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號1150688，規(guī)格：30 mg）；格列喹酮對照品（批號00280-200301，純度≥99.5%）；格列齊特對照品（內(nèi)標(biāo)，批號100269-2006030，純度≥99.9%）均來自中國藥品生物制品鑒定所；乙腈、甲醇和乙醚分別為色譜純和分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），三蒸水（實驗室自制）。

1.3 主要儀器

Shimadzu 色譜系統(tǒng)包括：LC-10AT VP Plus 輸液泵、SPD-10A VP Plus 紫外檢測器、CBM-10AVP Plus控制器、LC Solution lite 色譜工作站；AUY220型電子天平（日本京都，Shimadzu）；EXPERT 16K-R 臺式高速冷凍離心機（長沙市鑫奧儀器儀表有限公司）；實驗室pH 計FE20[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.4 實驗方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取格列喹酮對照品10.0 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容配制成400 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用甲醇稀釋成200、100、50、25、10、5 與2.5 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱保存。內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱取格列齊特適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為400 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，臨用時用甲醇稀釋成25 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4.2 血漿樣品的處理 取大鼠血漿150 μL置入肝素化處理過的離心管中，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,加入1 mL萃取溶液（二氯甲烷：乙醚，1∶4），渦旋混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液，在空氣流下?lián)]干溶劑，殘渣用200 μL流動相復(fù)溶，渦旋混勻，12 000 r/min再離心10 min，取20 μL上清液，即得。

1.4.3 色譜條件 色譜柱為Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為磷酸氫二銨水溶液（取磷酸1.725 g，加三蒸水300 mL 溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.5）-乙腈（3∶5，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20 μL；檢測波長：225 nm；內(nèi)標(biāo)：25 μg/mL的格列齊特。

1.4.4 專屬性 取空白血漿、加標(biāo)血漿以及給藥后血漿各150 μL，按“1.4.2”項下方法操作。

1.4.5 線性、檢測限和定量限 取空白血漿150 μL數(shù)份，分別加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，制成相當(dāng)于濃度 20、10、5、2.5、1、0.5、0.25 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。然后按“1.4.2”項下方法操作。

1.4.6 精密度與回收率試驗 取空白血漿150 μL數(shù)份，分別加系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，制成低、中、高（0.5、2.5和20 μg/mL）3種濃度的質(zhì)控樣品，每種濃度5 份，按照“1.4.2”項下方法處理后，分別在同一天連續(xù)測定和連續(xù)測定3 d，然后計算質(zhì)控樣品的精密度和回收率。

1.4.7 穩(wěn)定性試驗 將配制好的質(zhì)控樣品分別在室溫放置0、12、24 h，按照“1.4.2”項下方法處理后，進樣分析。

1.4.8 藥動學(xué)試驗 將18只SD大鼠隨機分成3組：格列喹酮對照組、高劑量阿司匹林+格列喹酮組及低劑量阿司匹林+格列喹酮組。格列喹酮對照組單獨灌胃給予90 mg/kg 的格列喹酮混懸水溶液，高劑量阿司匹林+格列喹酮組及低劑量阿司匹林+格列喹酮組先分別連續(xù)2 d 單獨灌胃給予100 mg/kg 和50 mg/kg 的阿司匹林混懸水溶液，第3 天給予相同劑量的阿司匹林20 min 后再給予90 mg/kg 的格列喹酮混懸水溶液。采血前12 h 大鼠禁食不禁水，給藥后分別在 10、20、40、60、90、120、180、300、420、540、660、1 440 min 時間點從大鼠頸靜脈處采血約0.35 mL，置于 1.5 mL 肝素化的 Eppendorf 試管中，3 500 r/min 離心 10 min 后取上層血漿 150 μL，按照“1.4.2”項下方法處理后，進樣分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用WinNonlin5.2 藥動學(xué)軟件分析藥動學(xué)特征并計算相關(guān)參數(shù)；用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對藥動學(xué)參數(shù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用（）表示，t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

按照本實驗色譜條件分析得出，格列喹酮保留時間約為11.9 min，內(nèi)標(biāo)格列齊特保留時間約為7.0 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對其基本無干擾，說明該方法具有良好的專屬性，可以滿足實驗基本要求（圖1）。

圖1 格列喹酮HPLC色譜圖

2.2 線性、檢測限和定量限

按“1.4.5”項操作后,以格列喹酮的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），以其與內(nèi)標(biāo)格列齊特的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），進行回歸計算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.1017X-0.0345，R2=0.9993，可見格列喹酮在0.25～20 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限(S/N=10)為0.25 μg/mL。

2.3 精密度與回收率試驗

按“1.4.6”項操作后，格列喹酮高、中、低3種濃度的日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard devi‐tion，RSD）分別為8.9%、9.3%、5.1%、7.1%、4.8%、9.1%，均＜10%。各樣品的提取回收率分別為94.7%、98.4%、105.1%，均在85%～115%。結(jié)果表明，該方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品的分析方法要求。

2.4 穩(wěn)定性試驗

按“1.4.7”項操作后，測得放置不同時間后的樣品測定結(jié)果RSD 均＜8.7%；反復(fù)凍融3 次后再進樣分析，RSD均＜9.2%；各血漿樣品在低溫（-40 ℃）條件下放置30 d 后再進樣分析，結(jié)果RSD 均＜10.3%，表明血漿樣品具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 藥動學(xué)結(jié)果

按本實驗建立的方法測得單用及合用不同劑量阿司匹林后格列喹酮的血藥濃度，以時間為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)，繪制血藥濃度-時間曲線圖，結(jié)果見圖2。

圖2 格列喹酮平均血藥濃度-時間曲線圖

對藥時曲線中的數(shù)據(jù)用WinNonlin5.2 藥動學(xué)軟件進行處理，經(jīng)擬合對照組與聯(lián)合用藥組均符合二室模型，藥動學(xué)參數(shù)詳見表1。從表1 可以看出，高劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組和低劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組分別與對照組相比，半衰期（t1/2）分別上升了36.22%和29.85%，藥時曲線下總面積（AUC0～∞）分別上升了56.56%和29.01%，表觀分布容積（Vd）分別上升了56.21%和35.54%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其他藥動學(xué)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組與高劑量阿司匹林聯(lián)合用藥組相比，除AUC0～∞有顯著性差異外（P＜0.05），其它藥動學(xué)參數(shù)差異均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 格列喹酮的藥動學(xué)參數(shù)（n=6，）

表1 格列喹酮的藥動學(xué)參數(shù)（n=6，）

注：a表示與對照組相比P＜0.05；b表示低劑量聯(lián)合用藥組與高劑量聯(lián)合用藥組相比，P＜0.05

低劑量阿司匹林+格列喹酮組10.18±1.35a 2.05±1.09 7.33±2.45 125.58±15.23ab 14087.15±3455.50a 1078.17±249.14藥動學(xué)參數(shù)t1/2（h）Tmax（h）Cmax（μg/ml）AUC0～∞（h·μg/ml）Vd（ml）CL（ml/h）格列喹酮對照組7.84±3.71 1.92±0.61 5.63±3.54 97.34±18.51 10393.07±2211.91 1012.09±311.51高劑量阿司匹林+格列喹酮組10.68±2.35a 2.20±0.85 9.10±4.19 152.40±28.80a 16235.49±3028.41a 1045.00±347.29

3 討論

藥物的相互作用是導(dǎo)致藥物發(fā)生不良反應(yīng)的主要因素之一，其可以發(fā)生在藥物吸收、分布、代謝、排泄的任一過程[6]。阿司匹林和格列喹酮是臨床上常用的藥物，其聯(lián)合使用概率極大。

本研究主要考察了50 mg/kg 和100 mg/kg 的阿司匹林對格列喹酮在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響。結(jié)果表明，阿司匹林兩個劑量組與格列喹酮聯(lián)合用藥后，其t1/2、AUC0～∞和 Vd均顯著增大，但 Tmax，Cmax，CL等參數(shù)無顯著性差異。

已有研究證實肝臟中的CYP450 酶活性是影響藥物半衰期長短的主要因素之一[7]，Holstein A等[8]的研究顯示格列喹酮主要經(jīng)CYP2C9代謝，戴亨紛等[9]的研究同時也顯示阿司匹林的代謝與CYP2C9有關(guān)。因此，格列喹酮與阿司匹林聯(lián)合用藥時，由于競爭相同的代謝酶，導(dǎo)致了格列喹酮代謝的減慢，使得格列喹酮的t1/2延長。同時，由于阿司匹林和格列喹酮競爭性地結(jié)合血漿蛋白，當(dāng)兩藥合用時，格列喹酮從血漿蛋白結(jié)合部位游離出來，使其相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)增大，從而增強格列喹酮的藥物作用[10]。

本研究同時顯示，阿司匹林兩個劑量組對格列喹酮的CL 無影響。其原因是格列喹酮主要經(jīng)膽汁從糞便排出，只有5%經(jīng)腎臟排出[11-12]，而阿司匹林主要經(jīng)腎臟排泄（其中90%以結(jié)合型，10%以游離型排出）[13]。由于二者的排泄途徑不一，使得阿司匹林對格列喹酮的排泄方面沒有影響。

總之，從格列喹酮的吸收和代謝方面來看，聯(lián)合用藥后，阿司匹林對格列喹酮存在明顯的藥動學(xué)影響，這種影響程度可能與服用阿司匹林的劑量相關(guān)。當(dāng)格列喹酮與不同劑量的阿司匹林聯(lián)合使用后，格列喹酮在大鼠體內(nèi)的t1/2、AUC0～∞和Vd均顯著增大，說明藥物的作用時間延長，藥物效用增強。

本研究雖然證實了聯(lián)合使用阿司匹林和格列喹酮后，格列喹酮在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)發(fā)生了顯著改變,但實際用藥中兩藥的給藥次數(shù)、給藥劑量及人與大鼠對格列喹酮代謝存在種屬差異，因此，有必要開展后續(xù)研究以明確兩者在臨床上合并用藥時的藥動學(xué)相互作用，以確保安全、合理用藥。