劉均 ，李強(qiáng) ，譚蓉 *

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

青錢柳（Cyclocarya paliurus，CP）屬于胡桃科青錢柳屬植物，是古老珍稀樹種，僅存于中國(guó)。衛(wèi)健委2013 年第10 號(hào)公告將CP 葉納入新食品原料管理， 標(biāo)志著其可以直接應(yīng)用于食品或功能食品中。 目前，市場(chǎng)上以CP 單品或者與其它相近功能的原料復(fù)配開發(fā)的功能產(chǎn)品琳瑯滿目， 種類繁多。但其在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用方面， 主要存在兩點(diǎn)限制性因素，一是CP 葉水浸出物藥味濃郁、甜味過重影響口感；二是產(chǎn)品實(shí)際功效尚缺乏現(xiàn)代科學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)論證分析。 因此，研究主要針對(duì)第二方面限制性因素，采用新構(gòu)建的糖代謝異常斑馬魚（Zebrafish）模型對(duì)CP 葉水全浸出物進(jìn)行降糖作用評(píng)估，也為降糖藥物的篩選和降糖組方開發(fā)提供新的策略。

斑馬魚是一種脊椎模式生物， 與人類基因具有高度相似性，已成為生命科學(xué)研究的新寵。利用斑馬魚構(gòu)建人類疾病模型，如糖尿病[1-2]、高血脂[3-4]、高尿酸癥[5-6]、失眠[7-8]等可以有效開展靶向藥物篩選以及藥物安全與毒理評(píng)價(jià)研究。 斑馬魚具有個(gè)體小、發(fā)育周期短、實(shí)驗(yàn)周期短、費(fèi)用低、單次產(chǎn)卵數(shù)較高、 實(shí)驗(yàn)用藥量小等顯著優(yōu)勢(shì)可以有效縮短實(shí)驗(yàn)周期和節(jié)約試驗(yàn)成本。 斑馬魚實(shí)驗(yàn)屬于在體研究，可以作為連接非脊椎動(dòng)物（細(xì)胞等）和哺乳動(dòng)物（大小鼠等）實(shí)驗(yàn)之間的生物學(xué)斷層，完善現(xiàn)有藥物研發(fā)體系。糖尿病是一種世界性疾病，目前尚無有效的治愈措施， 長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)容易引起機(jī)體的糖耐量受損、胰島素敏感性降低，以及誘發(fā)諸如肝臟、腎臟等多種重要臟器衰竭，對(duì)健康威脅甚巨。因此，構(gòu)建適用性和實(shí)用性強(qiáng)的糖尿病病理模型是十分重要的。 斑馬魚是一種新興的模型生物，使用其開展在體藥物安全性和功能性研究，可以加快糖尿病治療藥物篩選或研發(fā)。

目前在糖尿病建模方面， 主要是以斑馬魚成魚為主， 采用的造模方式與大小鼠糖尿病造模方式相近，方法主要為：腹腔注射特定劑量的四氧嘧啶（Alloxan，ALX）或鏈脲佐菌素[9-10]溶液；ALX 溶液與葡萄糖（glucose，GLU）溶液聯(lián)用誘導(dǎo)建模[11]；采用過度飼喂法建立胰島素抵抗型糖尿病[12]。SHIN 等[11]研究發(fā)現(xiàn)采用 300 mg/100 mL ALX 溶液誘導(dǎo)30 min， 再用 1% GLU 溶液孵育 30 min，最后在水溶液中孵育1 h 可以誘導(dǎo)建立斑馬魚高血糖模型。ZANG 等[12]采用每天喂食6 次的過度喂養(yǎng)法進(jìn)行建模，斑馬魚空腹血糖水平顯著增加，可以有效建立2 型糖尿病模型。 勞喬聰[13]以4 dpf（days post fertilization）斑馬魚為對(duì)象，聯(lián)用40 mg/mL 蔗糖與1 mM ALX 可以有效建立糖尿病模型。目前以斑馬魚幼魚為對(duì)象， 開展糖尿病斑馬魚生物模型建設(shè)的研究報(bào)道還較為鮮見。 研究以5 dpf斑馬魚為對(duì)象， 采用GLU 單獨(dú)或與ALX 誘導(dǎo)藥物聯(lián)合探討建立基于生理和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型，并同時(shí)結(jié)合模型開展了CP 葉全水浸物的降糖作用評(píng)估， 為功能性代茶飲開發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料制備及試劑

50 mg/mL CP（文成縣泉山中藥材種植有限公司）儲(chǔ)備液制備：稱取5 g CP 于燒杯中，在80 ℃恒溫水浴鍋中浸提3 次，每次浸提30 min，合并濾液定容至100 mL， 保存于4 ℃冷藏備用。 50 mg/mL 阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）貯備液制備：稱取5 g ACA 于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙膺^濾后定容至100 mL， 保存于4℃冷藏備用；ALX （CAS 號(hào)：2244-11-3， 純度≥98.0%， 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）：144 μg/mL ALX 母液制備， 稱量0.0144 g ALX 于燒杯中，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙獠⒍ㄈ萦?00 mL 容量瓶中， 冷藏備用。 GLU （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三卡因甲磺酸（CAS 號(hào)：886-86-2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 磷酸緩沖鹽溶液（pH7.02，南京建成生物工程研究所）；GLU 檢測(cè)試劑盒 （葡萄糖氧化酶法， 南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀（Multiskan SkyHigh， 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司）；全自動(dòng)智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱 （天津市宏諾儀器有限公司）； 精密電子天平（AL-204，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；手持式高速勻漿機(jī)（MY-20，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；離心機(jī)（3K1S，德國(guó)sigma 離心機(jī)公司）；水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚（3 月齡，AB 型，上海費(fèi)曦生物科技有限公司）。 斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進(jìn)行。 每個(gè)產(chǎn)卵盒中按1：1 放入公魚和母魚， 放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。光周期設(shè)置為：14 h 光照與10 h 黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便， 清洗后換孵育水 （60 μg/mL 海鹽水）， 置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫孵育， 每24 h 換水一次，并去掉卵膜和死卵。 處理結(jié)束時(shí)，采用三卡因甲磺酸對(duì)斑馬魚進(jìn)行麻醉處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GLU 與ALX 聯(lián)用建立糖尿病模型可行性及有效性研究

（1）聯(lián)合建?？尚行裕夯谇捌谘芯炕A(chǔ)[14]，將發(fā)育正常5 dpf 野生型AB 系斑馬魚隨機(jī)分為4組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 15 條，分別給予 0 mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.04 mM ALX 溶液， 分別記為 T0、T1、T2、T3，每個(gè)重復(fù)加藥物 5 mL。 培養(yǎng) 24 h 后，每個(gè)重復(fù)取10 條魚檢測(cè)組織GLU 含量， 探究 GLU 與ALX 聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的可行性。

（2）聯(lián)合建模有效性：基于上述研究，將發(fā)育正常5 dpf 野生型 AB 系斑馬魚采用22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX 藥物聯(lián)合孵育24 h 以建立糖尿病模型， 然后將其隨機(jī)分成4 組， 每組3 個(gè)重復(fù)， 每個(gè)重復(fù)20 條， 分別給予22 mg/mL GLU+0 mM ACA、22 mg/mL GLU+250 μg/mL ACA、22 mg/mL GLU+500 μg/mL ACA、22 mg/mL GLU+750 μg/mL ACA 溶 液 ， 分 別 記 為 MC、T-ACA250、TACA500、T-ACA750，每個(gè)重復(fù)加藥物 6 mL，同步設(shè)置正常斑馬魚采用0 mg/mL GLU+0 mM ACA 孵育48 h（期間孵育24 h 時(shí)換水一次）作為空白對(duì)照組BC。 培養(yǎng)24 h 后，每個(gè)重復(fù)取10 條魚檢測(cè)組織GLU 含量， 探究GLU 與ALX 聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的有效性。

1.2.2 基于生理和病理生理的斑馬魚模型評(píng)估CP降糖作用

（1） 不同濃度CP 對(duì)高糖溶液誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚糖代謝影響

將發(fā)育正常5 dpf 野生型AB 系斑馬魚隨機(jī)分為5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 條，分別給予 0 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU+250 μg/mL CP、22 mg/mL GLU+500 μg/mL CP、22 mg/mL GLU+750 μg/mL CP 溶液， 分別記為 C1、C2、T-CP250、T-CP500、T-CP750， 每個(gè)重復(fù)加藥物 5 mL。 培養(yǎng)至24 h 后，每個(gè)重復(fù)取 10 條魚測(cè)定GLU 含量，研究基于高糖誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚模型評(píng)估CP 的控糖作用。

（2） 不同濃度CP 對(duì)糖尿病斑馬魚糖代謝影響

將發(fā)育正常5 dpf 野生型AB 系斑馬魚采用22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX 聯(lián)合孵育 24 h 以誘導(dǎo)糖尿病模型并隨機(jī)分為2 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 條，分別給予22 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU+250 μg/mL CP 聯(lián)合孵育 24 h， 分別記為 PC和T250 組，每個(gè)重復(fù)加藥物6 mL，同步設(shè)置正常斑馬魚采用0 mg/mL GLU 孵育48 h（期間孵育24 h 時(shí)換水一次）作為空白對(duì)照組CK。 結(jié)束后，每個(gè)重復(fù)取10 條魚測(cè)定GLU 含量， 研究基于糖尿病糖斑馬魚模型評(píng)估CP 的降糖作用。

1.3 檢測(cè)方法

GLU 含量檢測(cè)按如下步驟進(jìn)行：取100 μL 磷酸緩沖鹽溶液于裝魚的1.5 mL 離心管中，采用高速手持式勻漿機(jī)勻漿1 min，直至魚體組織裂解充分，然后于 4 ℃下以 2500 轉(zhuǎn)/秒離心 10 min，結(jié)束后取上清樣2.5 μL 采用 GLU 檢測(cè)試劑盒（GLU氧化酶法）測(cè)定GLU 濃度，其測(cè)定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步處理后，用Graphpad Prism 6.0 繪圖，并用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)， 差異顯著性采用Duncan 分析并將進(jìn)行多重比較，p＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GLU 與ALX 聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型可行性及有效性分析

從圖 1a 中可以看出， 相較于 T0 組，T1 組斑馬魚 GLU 值增加了 6.80 倍（p＜0.05）；T2 和 T3 組斑馬魚 GLU 值分別增加了 7.52 倍 （p＜0.05）和9.15 倍（p＜0.05）。 與 T1 組相比，T2 和 T3 組斑馬魚 GLU 值分別增加了 9.24%（p＞0.05） 和 30.14%（p＞0.05）。 結(jié)果表明以 22 mg/mL GLU 與 0.02 和0.04 mM ALX 聯(lián)用具有建立糖尿病斑馬魚的可行性。 從圖1b 中可以看出，與T0 組相比，采用T1、T2 和T3 組斑馬魚平均體重都有一定程度的增加（p＞0.05）， 這可能與外源營(yíng)養(yǎng)供給有關(guān)。 而與 T1組相比，T2 和T3 組斑馬魚平均體重有一定程度的下降（p＞0.05）。 綜合圖 1a 和 1b 結(jié)果表明，采用22 mg/mL GLU 與 0.02 和 0.04 mM ALX 聯(lián)合建立的糖尿病斑馬魚的癥狀與糖尿病患者具有的 “高血糖、體重減輕”典型癥狀具有相似性[15]。 因孵育24 h， 時(shí)間周期較短， 較長(zhǎng)孵育時(shí)間下的斑馬魚GLU 值和體重變化情況還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。 圖1c 反映的是孵育24 h 結(jié)束后，孵育液中的GLU 值變化情況。 從圖 1c 中可以看出，T2 和 T3組孵育液中的GLU 值水平明顯高于T1 組， 分別高出 8.65%（p＜0.05）和 5.13%（p＞0.05），表明采用22 mg/mL GLU 與 0.02 和 0.04 mM ALX 聯(lián)合處理時(shí)從孵育液中吸收的GLU 含量有所降低。

綜合圖1 結(jié)果來看， 相較于高糖溶液誘導(dǎo)的生理模型，GLU 與ALX 聯(lián)合建立的胰島損傷型病理模型的斑馬魚從孵育液中吸收較少的GLU，體重減輕，但組織GLU 值卻顯著增加。 研究表明，胰島損傷會(huì)造成胰島素分泌不足， 進(jìn)而影響體內(nèi)GLU 的消耗供能[16-17]，機(jī)體能量供應(yīng)不足后刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的GLU[18-19]。因GLU 與ALX 聯(lián)合造模組斑馬魚未從孵育液中吸收更多的GLU， 因而推測(cè)顯著增加的GLU 推測(cè)可能來源于斑馬魚幼魚體內(nèi)卵黃囊的消耗供能有關(guān)， 這也與體重減輕癥狀相印證。

圖1 葡萄糖與四氧嘧啶聯(lián)合建立糖尿病模型的可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of the combination of glucose and alloxan in the establishment of model of diabetes mellitus

從圖2a 中可以看出，與BC 組相比，MC 斑馬魚 GLU 值顯著增加，增長(zhǎng)了 7.03 倍（p＜0.05），與前述研究具有一致性。 ACA 為常見糖尿病的治療藥物， 研究發(fā)現(xiàn)， 與 MC 組相比，T-ACA250、TACA500 和T-ACA750 組斑馬魚GLU 值顯著降低（p＜0.05），分別降低了 55.10%、50.17%和 44.31%，表明以此方法建立的糖尿病斑馬魚是有效的。 圖2b 和 c 顯 示 ， 相 較 于 MC 組 ，T-ACA250、TACA500 和T-ACA750 組斑馬魚體重顯著增加，250、500 和 750 μg/mL ACA 處理組分別增加了14.8%、25.91%和 25.91%，差異均顯著（p＜0.05）。T-ACA250、T-ACA500 和 T-ACA750 組孵育液中的 GLU 水平均比 MC1 組低 （p＞0.05）， 表明采用ACA 治療后斑馬魚從孵育液中吸收的能量物質(zhì)有一定程度的增加。

綜合圖2 結(jié)果來看，相較于MC 組，采用ACA治療后斑馬魚從孵育液中吸收的GLU 量增加，但斑馬魚組織GLU 值降低，這可能與糖尿病癥狀減輕、斑馬魚的GLU 利用率提高、體內(nèi)合成代謝增強(qiáng)、使得斑馬魚平均體重增加有關(guān)。

圖2 葡萄糖與四氧嘧啶聯(lián)合建立糖尿病模型可行性有效性分析Fig.2 Effectiveness analysis of the combination of glucose and alloxan in the establishment of model of diabetes mellitus

2.2 CP 降糖作用分析

2.2.1 CP 對(duì)高糖溶液誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚的降糖作用

基于以上研究發(fā)現(xiàn)采用22 mg/mL GLU 處理可以建立基于生理的糖代謝異常斑馬魚模型，并采用該模型對(duì)CP 的降糖作用進(jìn)行研究。 圖3a 顯示，相比 C1 組，C2 組斑馬魚 GLU 值顯著增加，增加了 2.98 倍（p＜0.05）。 相比 BC2 組，T-CP250、TCP500 和T-CP750 組斑馬魚GLU 值顯著降低，分別降低了41.67%、48.33%和60.97%，差異均顯著（p＜0.05），但 CP 治療組間未出現(xiàn)顯著性變化（p＞0.05）。 圖 3b 和 c 顯示， 相比 C2 組，T-CP250、TCP500 和T-CP750 組斑馬魚體重有一定程度的增加，分別增加了2.43%、2.43%和7.32%，差異均不顯著（p＞0.05）；孵育液中 GLU 水平分別變化了-2.45%、-5.55%、3.10%，差異均不顯著（p＞0.05）。綜合圖3，CP 除了具有降糖作用外，還對(duì)機(jī)體健康有益，有助于提高GLU 的利用效率。

圖3 不同濃度青錢柳葉水提物對(duì)高糖溶液誘導(dǎo)斑馬魚組織葡萄糖值（a）、體重（b）和孵育液葡糖糖值（c）的影響Fig.3 Effects of different concentrations of the aqueous extract of Cyclocarya paliurus leaves on the level of glucose in tissue of zebrafish （a）， body weight （b） and the level of glucose （c） of culture medium induced by high glucose solution

2.2.2 CP 對(duì)糖尿病斑馬魚的降糖作用

采用基于病理的糖尿病斑馬魚模型進(jìn)行低劑量濃度CP 對(duì)糖尿病的降糖效應(yīng)研究。 從圖4a 中可以看出， 與CK 組相比，PC 組顯著增加斑馬魚GLU 值，增加了3.88 倍（p＜0.05）。 與 PC 組相比，T250 組斑馬魚GLU 值顯著降低， 降低了29.97%（p＜0.05）。 圖 4b 和 c 顯示，PC 和T250 組斑馬魚體重均比 CK 組高 （p＞0.05）；T250 組比 PC 組高14.80%（p＞0.05）。 PC 和 T250 組間孵育液中 GLU水平變化較小，T250 組僅比 PC 組高 1.40%（p＞0.05）。 綜合圖4，結(jié)果表明CP 處理并未明顯促進(jìn)外源能量物質(zhì)吸收， 但平均體重增加， 組織GLU值水平顯著降低，表明CP 具有明顯的降糖效應(yīng)，并且可能具有改善機(jī)體健康，促進(jìn)GLU 利用的作用，與增加斑馬魚體重的作用有關(guān)。因此基于病理生理的糖尿病斑馬魚模型的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示CP 具有明顯的降糖效應(yīng)， 其降糖機(jī)制可能與促進(jìn)組織對(duì)GLU 的高效利用有關(guān)。

圖4 青錢柳葉水提物對(duì)糖尿病斑馬魚組織葡萄糖值（a）、體重（b）和孵育液葡萄糖值（c）的影響Fig.4 Effects of the aqueous extract of Cyclocarya paliurus leaves on the level of glucose in the tissue of zebrafish（a）， body weight （b） and the level of glucose （c） in culture medium of diabetic zebrafish

3 討論

目前研究中構(gòu)建的糖尿病斑馬魚模型以成魚為主， 采用斑馬魚幼魚建模的研究目前還比較鮮見。但相比于使用斑馬魚成魚建模來說，采用幼魚建模操作更為簡(jiǎn)便，采用多孔板操作試驗(yàn)方便，樣本量大 （每組45~60 條魚）， 試驗(yàn)周期短 （24~48 h）。 顯然以斑馬魚幼魚構(gòu)建糖尿病斑馬魚高通量藥物篩選模型更具有明顯的可操作性和便捷性優(yōu)勢(shì)。 因此研究以5 dpf 斑馬魚為對(duì)象，采用單糖GLU 單獨(dú)或與ALX 誘導(dǎo)藥物聯(lián)合探討建立基于生理的和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型，為降糖藥物的篩選和健康功能飲品開發(fā)提供新的策略。

GLU 是機(jī)體的主要供能物質(zhì)， 可以在腸道上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的輔助下從腸道內(nèi)直接吸收[11]。 研究發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚幼魚直接暴露于高GLU溶液中可以誘導(dǎo)建立基于生理的糖代謝異常斑馬魚模型，這與GLU 在腸道內(nèi)的直接吸收方式是有關(guān)的，當(dāng)攝入量超過消耗量，機(jī)體的GLU 顯著增加。ALX 是嘧啶的一種含氧衍生物，通過產(chǎn)生氧自由基來選擇性地破壞胰島β 細(xì)胞，引起細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致胰島素分泌量下降， 形成胰島素依賴性糖尿病[12]。 研究還發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚幼魚暴露于高GLU 與ALX 溶液中可以進(jìn)一步提升斑馬魚GLU值，可建立基于病理生理的糖代謝異常（糖尿?。┠Ｐ?。

在外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和體重變化方面， 給予高糖溶液孵育體重跟不給予組相比體重有增加趨勢(shì)， 這可能與外源營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)促進(jìn)和提高幼魚的生長(zhǎng)發(fā)育速度有關(guān)。 在均給予高糖溶液孵育的條件下，ALX 的給予在一定程度上降低了從孵育液中吸收外源能量物質(zhì)的量，體重有減輕趨勢(shì)，但斑馬魚GLU 值顯著增加， 推測(cè)ALX 造成機(jī)體胰島損傷后可能下調(diào)了外源物質(zhì)吸收， 體內(nèi)GLU 利用效率降低，在機(jī)體供需補(bǔ)償下卻促進(jìn)了內(nèi)源物質(zhì)的消耗，進(jìn)而呈現(xiàn)出體重下降和體內(nèi)GLU 累積增加[17-18]。 因孵育時(shí)間較短，長(zhǎng)時(shí)孵育下是否發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律性變化還需進(jìn)一步研究與分析。

基于已建立的的生理的和病理生理的斑馬魚模型， 研究發(fā)現(xiàn) 250、500 和 750 μg/mL CP 可以顯著降低22 mg/mL GLU 誘導(dǎo)的斑馬魚GLU 值。更重要的是，250 μg/mL 可以顯著降低糖尿病斑馬魚（22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX 聯(lián)合孵育 24 h）GLU 值，并改善機(jī)體的健康狀態(tài)。 GLU 是最基礎(chǔ)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 其進(jìn)入腸道內(nèi)可以直接被吸收，因而CP 在研究中的降糖效應(yīng)與抑制外源糖類在腸道內(nèi)的消化作用是無關(guān)的， 同時(shí)綜合孵育液中GLU 水平和斑馬魚體重變化， 推測(cè)可能的降糖作用機(jī)制與減輕斑馬魚卵黃囊消耗， 改善機(jī)體健康狀態(tài)[20]，促進(jìn)胰島素分泌[21]提高體內(nèi)GLU利用率[22-24]有關(guān)。

另外結(jié)合當(dāng)前大小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示，CP 還可能具有保護(hù)并改善肝臟異常代謝[25-26]，保持血脂穩(wěn)定，增強(qiáng)抗氧化，保護(hù)胰腺等相關(guān)作用[27-28]。勞喬聰?shù)萚15]基于40 mg/mL 蔗糖與1 mM ALX 聯(lián)用建立糖尿病斑馬魚模型， 研究發(fā)現(xiàn)1000 和2000 μg/mL CP 可以顯著降低血糖值， 且降糖效果呈濃度依賴性。姚駿凱等[21]研究發(fā)現(xiàn)CP 可以降低糖尿病大鼠胰腺可溶性細(xì)胞凋亡因子配體、 可溶性細(xì)胞凋亡因子、 活化半胱氨酸蛋白酶8 含量以及磷酸化c-Jun 氨基端激酶1 和總c-Jun 氨基端激酶1的表達(dá)量， 表明CP 降血糖作用機(jī)制可能與抑制胰腺β 細(xì)胞凋亡有關(guān)。姚駿凱等[20]研究發(fā)現(xiàn)CP 可以顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖和胰島素抵抗指數(shù)，顯著增加胰島素受體底物1 蛋白mRNA 的表達(dá)， 以及肝臟磷酸化胰島素受體底物1/胰島素受體底物1 蛋白比值。 肝臟在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用。 另外研究還發(fā)現(xiàn)[25-26]CP 可以抑制糖尿病大鼠肝臟組織中與脂肪酸代謝、 依賴于細(xì)胞色素P450 的異物代謝等過程， 同時(shí)還下調(diào)了miR-200a-3p、miR-100-3p、miR-375-3p 和 miR-221-5p 的表達(dá)， 表明CP 具有改善肝臟異常代謝來預(yù)防糖尿病的作用[20-21]。

下一步工作將圍繞已建立的基于生理和病理生理的糖代謝異常模型，開展CP 毒理學(xué)（安全性評(píng)價(jià)和劑量學(xué)估算）研究，尤其是充分結(jié)合斑馬魚幼魚透明和可以進(jìn)行活體染色鏡檢的顯著優(yōu)勢(shì)開展器官藥物毒理損傷作用研究， 以及以我國(guó)食品上準(zhǔn)入的藥用植物資源為核心開展復(fù)方配伍降糖增效作用研究， 為健康功能食品或飲品開發(fā)提供基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

研究以5 dpf 斑馬魚為對(duì)象， 采用22 mg/mL GLU 單獨(dú)或與0.02 和0.04 mM ALX 溶液聯(lián)合孵育24 h 探索建立了基于生理的和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型。結(jié)果顯示，相較于0 mg/mL GLU 組 ，22 mg/mL GLU 單 獨(dú) 或 與 0.02 和 0.04 mM ALX 聯(lián)合處理組斑馬魚GLU 值顯著增加，分別增加了 6.80 倍 （p＜0.05）、7.52 倍 （p＜0.05）和9.15 倍（p＜0.05）。 采用臨床常用糖尿病治療藥物ACA 進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，250、500和750 μg/mL ACA 治療可以顯著降低糖尿病斑馬 魚 GLU 值 ， 分 別 降 低 了 55.10% （p ＜0.05）、50.17%（p＜0.05） 和 44.31%（p＜0.05）， 表明以 22 mg/mL 與0.02 mM ALX 溶液聯(lián)合建立的糖尿病斑馬魚是有效的。 經(jīng)斑馬魚模型評(píng)價(jià)， 相比模型組，250、500 和 750 μg/mL CP 可以顯著降低 22 mg/mL 誘導(dǎo)的斑馬魚 GLU 值， 分別降低了41.67%、48.33%和60.97%，差異均顯著（p＜0.05）；250 μg/mL CP 治療可以顯著降低22 mg/mL GLU與0.02 ALX 溶液處理的斑馬魚GLU 值， 降低了29.97%（p＜0.05），另對(duì)體重有一定的改善作用。 結(jié)果表明，CP 具有明顯的降糖效應(yīng)， 其降糖機(jī)制可能與改善機(jī)體的健康狀態(tài)和促進(jìn)GLU 的利用有關(guān)， 其在輔助降血糖功能食品飲料開發(fā)上具有廣闊的應(yīng)用前景。