劉均 ，李強(qiáng) ，譚蓉 *

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

沙棘（Hippophae rhamnoides Linn）是一種落葉性灌木，具有耐旱、抗風(fēng)沙特性，在我國西北地區(qū)有大量種植，主要用于水土保持和沙漠綠化。 沙棘是一種很重要的綠色生態(tài)資源，沙棘果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和功能活性物質(zhì)，是我國藏、蒙醫(yī)藥的常用材料，具有健脾養(yǎng)胃、滋陰壯陽之功效[1-2]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，取得了良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。 相較于沙棘果資源的開發(fā)利用， 沙棘葉（Hippophae rhamnoides Linn. leaf，HRLL） 資源的利用目前還處于起步階段。 HRLL 中也含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)， 約含有20.7%粗蛋白、4.1%粗脂肪、15.6%粗纖維，是一種良好的飼料原料，但目前市場上尚無沙棘飼料。 此外，HRLL 還含有豐富的沙棘多糖、黃酮、多酚、三萜和甾體類化合物等功能活性成分[3]，是活性成分提制的重要原料，尤其是其中含有的科羅索酸，具有“植物中的胰島素”之稱，在糖尿病治療上具有較高價(jià)值。 2013 年，根據(jù)中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)通告（2013年第 3 號(hào)），HRLL 被納入普通食品管理， 標(biāo)志HRLL 在我國食品和功能食品上的應(yīng)用準(zhǔn)入。 目前， 我國北方地區(qū)正積極開展HRLL 代用茶試制研究及產(chǎn)品開發(fā)，但尚無暢銷產(chǎn)品。在HRLL 代用茶開發(fā)方面，主要存在兩個(gè)問題，一是HRLL 表面白絨毛過多，泡飲時(shí)漂浮水表影響美觀和消費(fèi)者粘度；二是其泡飲下的全浸出物實(shí)際功效有待考證。

斑馬魚是一種新興模式生物， 與人類基因的相似度達(dá)到87%， 通過在體研究可以有效彌補(bǔ)體外實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞試驗(yàn)）和哺乳類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（大小鼠）之間的生物學(xué)斷層，完善現(xiàn)有藥物研發(fā)體系。 而且，斑馬魚養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精、體外發(fā)育、胚體透明，已成為生命科學(xué)研究的新寵。 目前利用斑馬魚，可以構(gòu)建糖尿病[4-5]、高血脂[6-7]、高尿酸癥[8-9]、失眠[10-11]等疾病模型，開展藥物篩選、安全與毒理評(píng)價(jià)。 因此，研究以5 dpf（days post fertilization）斑馬魚為對(duì)象，系統(tǒng)研究了不同濃度不同孵育時(shí)間下斑馬魚對(duì)HRLL 耐受性的影響， 并指導(dǎo)基于正常生理和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型開展HRLL 降糖功效評(píng)價(jià)，為HRLL 健康茶飲開發(fā)提供基礎(chǔ)理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料制備

HRLL 鮮葉原料采摘自山西， 參照綠茶加工工藝制造。鮮葉經(jīng)過萎凋后，先經(jīng)260~280 ℃滾筒電熱殺青，攤涼后揉捻機(jī)揉捻30 min，110~120 ℃炒干制成卷曲形顆粒產(chǎn)品。 采用類似茶葉泡飲提取方法（料水比1：20）制備貯備液：稱取5 g HRLL于燒杯中，在80 ℃恒溫水浴鍋中浸提3 次，每次浸提30 min， 合并濾液并定容至100 mL 制得50 mg/mL HRLL （以生藥量計(jì)） 貯備液，4 ℃冷藏備用。準(zhǔn)確量取 0、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00 和 10.00 mL 上述 HRLL 儲(chǔ)備液， 加蒸餾水定容至 50 mL， 分別制成 0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL 的 HRLL 溶液， 用于開展斑馬魚對(duì)不同濃度HRLL 溶液耐受性的影響研究。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

全自動(dòng)智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱（天津市宏諾儀器有限公司）；離心機(jī)（3K1S，德國 sigma 離心機(jī)公司）；手持式高速勻漿機(jī)（MY-20，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；酶標(biāo)儀（Multiskan SkyHigh， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；精密電子天平（AL-204，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；殺青機(jī)（6CSM-40 型，浙江春江茶葉機(jī)械有限公司）；揉捻機(jī)（6CRM-25 型，浙江春江茶葉機(jī)械有限公司）；雙鍋曲毫機(jī)（6CCQ-50 型，浙江春江茶葉機(jī)械有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

四氧嘧啶（ALX，CAS 號(hào)：2244-11-3，純度≥98.0 mg/mL）；阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；葡萄糖（glucose，GLU，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；GLU 檢測試劑盒 （葡萄糖氧化酶法，南京建成生物工程研究所）；三卡因甲磺酸（CAS 號(hào)：886-86-2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.02，南京建成生物工程研究所）。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚（3 月齡，AB 型，上海費(fèi)曦生物科技有限公司）。 斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進(jìn)行。 每個(gè)產(chǎn)卵盒中按1：1 放入公魚和母魚， 放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。采用光周期為：14 h 光照與10 小時(shí)黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便，清洗后換孵育水（60 μg/mL 海鹽水），置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫孵育，每24 h 換水一次，并去掉卵膜和死卵。 實(shí)驗(yàn)完成后，用三卡因甲磺酸對(duì)暴露將斑馬魚麻醉處死。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚對(duì)HRLL 的耐受性分析研究

將5 dpf 野生型AB 系斑馬魚隨機(jī)分為 12組，每組 3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 條，分別給予0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000 μg/mL HRLL 溶液（以生藥量計(jì)），并分別記為 T0~T10000， 每孔加藥物 5 mL 置于 28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每24 h 換水一次，記錄死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率。

1.2.2 HRLL 對(duì)基于正常生理和病理生理的斑馬魚模型的降糖作用研究

（1） HRLL 對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚模型降糖作用

基于HRLL 耐受性分析，按照HRLL 的10%~25% LC50劑量濃度[12-13]略作調(diào)整，評(píng)價(jià)用 HRLL 的劑量下限為 200 μg/mL，同時(shí)設(shè)置 400 和 800 μg/mL 劑量濃度開展降糖作用研究。 將5 dpf 野生型AB 系斑馬魚隨機(jī)分為5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù) 15 條， 分別給予 0 mg/mL GLU+0 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+0 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+200 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+400 μg/mL HRLL、10 mg/mL GLU+800 μg/mL HRLL 溶液，且分別記為 C1、C2、T1、T2 和 T3，每孔加藥物5 ml，置于28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)重復(fù)取10 條魚， 加入100 μL 磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測定GLU 含量。 研究主要基于糖代謝異常斑馬魚模型評(píng)估HRLL 控糖作用。

（2） HRLL 處理對(duì)糖尿病斑馬魚模型降糖作用

基于前期研究， 將5 dpf 野生型AB 系斑馬魚，給予10 mg/mL GLU+0.025 mM ALX 聯(lián)合孵育24 h 以構(gòu)建誘導(dǎo)糖尿病模型，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 條。 待孵育24 h 后， 再分別給予 10 mg/mL GLU 與 200、400 和 800 μg/mL HRLL 或 400 μg/mL ACA 聯(lián)合孵育 24 h， 分別記為 CM、 THRLL200、T-HRLL400、T-HRLL800、T-ACA400。同步設(shè)置正常斑馬魚采用0 mg/mL GLU 孵育48 h（期間24 h 換液一次）作為空白對(duì)照，記為CK。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)取10 條魚，加入200 μL 磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測定GLU 含量。 研究主要基于糖尿病斑馬魚模型評(píng)估HRLL 的降糖作用。

1.3 檢測方法

GLU 含量檢測按如下步驟進(jìn)行： 取適量磷酸緩沖鹽溶液于裝魚的1.5 mL 離心管中，采用高速手持式勻漿機(jī)勻漿1 min， 直至魚體組織裂解充分，然后于4 ℃下以2500 r/s 離心10 min，結(jié)束后取上清樣 2.5 μL 采用 GLU 檢測試劑盒 （GLU 氧化酶法）測定GLU 濃度，其測定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定的步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016 初步處理后，用Graphpad Prism 6.0 繪圖，并用SPSS Statistics 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)， 差異顯著性采用Duncan 分析并將進(jìn)行多重比較，p＜0.05 表示組間差異顯著。 利用 SPSS17.0 軟件中 Regression 中PROBIT 程序計(jì)算其 LC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 斑馬魚對(duì)HRLL 的耐受性分析

不同濃度HRLL 及孵育時(shí)間對(duì)斑馬魚幼魚死亡率的影響見圖1。 5 dpf 斑馬魚幼魚對(duì)高濃度HRLL 具有不耐受性， 當(dāng)HRLL 濃度小于等于1000 μg/mL 時(shí)死亡率較低， 死亡率在10%以下，當(dāng)濃度大于等于2000 μg/mL 死亡率陡增，死亡率超過 50%。 以孵育 24 h 為基準(zhǔn)， 采用SPSS 中PROBIT 程序分析得出斑馬魚的HRLL 耐受性如表1 所示， 死亡率與 HRLL 濃度間的關(guān)系為：probit（p）=-2.423+0.000977x，按該模型計(jì)算得出HRLL 的 LC50為 2479.41 μg/mL，95%可信范圍為2081.20~3034.93 μg/mL。 因此，若按照 10%~25%LC50劑量濃度 HRLL 的適宜劑量濃度范圍為247.94~619.85 μg/mL。

圖1 不同沙棘葉濃度及孵育時(shí)間對(duì)斑馬魚幼魚死亡率的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of Hippophae rhamnoides Linn. leaf and incubation time on the lethallty rate of zebrafish larvae

表1 斑馬魚幼魚沙棘葉耐受性影響的參數(shù)估計(jì)表Table 1 Parameter estimates of Hippophae rhamnoides Linn.leaf tolerance in zebrafish larvae

2.2 HRLL 對(duì)基于正常生理和病理生理的斑馬魚模型的降糖作用研究

2.2.1 HRLL 對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚模型降糖作用的影響

根據(jù)斑馬魚對(duì)HRLL 耐受性的分析結(jié)果，按照10%~25% LC50推薦量略作調(diào)整，選用200、400和800 μg/mL 劑量梯度組合開展HRLL 降糖作用研究，其對(duì)基于正常生理的斑馬魚GLU 值的影響見圖 2。 研究發(fā)現(xiàn)， 與 C1 組相比，C2 組斑馬魚GLU 值顯著增加，達(dá)到 126.68%（p＜0.05）。 另外與C2 組相比，T1、T2 和 T3 組斑馬魚 GLU 值顯著降低，分別降低了 33.06%（p＜0.05）、37.54%（p＜0.05）和 54.29%（p＜0.05）， 表明 HRLL 對(duì)高糖溶液誘導(dǎo)的正常生理的斑馬魚具有降糖效應(yīng)。

圖2 沙棘葉對(duì)高糖誘導(dǎo)斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.2 Effects of Hippophae rhamnoides Linn. leaf on the values of glucose of high glucose solutioninduced zebrafish

2.2.2 HRLL 處理對(duì)糖尿病斑馬魚模型降糖作用的影響

HRLL 對(duì)糖尿病斑馬魚GLU 值的影響見圖3。與CK 組相比，CM 組斑馬魚 GLU 值從 0.045 mM增加到 0.111 mM，增長了 148.54%（p＜0.05）。 相比 CM 組 ，T -HRLL200、T -HRLL400 和 T -HRLL800 組斑馬魚GLU 值分別降低了42.22%、64.47%和 59.49%， 均差異顯著 （p＜0.05）。 TACA400 組 斑馬魚 GLU 值降低 了 78.30%（p ＜0.05）。 結(jié)果表明，HRLL 對(duì)糖尿病斑馬魚明顯的降糖效應(yīng)， 但在同等劑量濃度下降糖作用弱于ACA。

圖3 沙棘葉對(duì)糖尿病斑馬魚葡萄糖值的影響Fig. 3 Effects of Hippophae rhamnoides Linn. leaf on the values of glucose of diabetic zebrafish

3 討論

GLU 是最基本糖類物質(zhì)， 可以在腸道上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）的輔助下從腸道內(nèi)直接被吸收[14]。 研究發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚幼魚直接暴露于10 mg/mL GLU 溶液中， 可以增加斑馬魚GLU 值， 這與 GLU 的吸收方式有關(guān)。 ALX 是嘧啶的一種含氧衍生物，通過選擇性地破壞胰島β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌量下降，形成胰島素依賴性糖尿病[15]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，以10 mg/mL GLU和0.025 mM ALX 聯(lián)合誘導(dǎo)24 h 可以顯著增加斑馬魚 GLU 值。 因此，研究以 10 mg/mL GLU 單獨(dú)或與0.025 mM ALX 聯(lián)合建立基于正常生理的和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型，在系統(tǒng)研究不同HRLL 濃度不同孵育時(shí)間下對(duì)斑馬魚幼魚生物耐受性的影響下指導(dǎo)開展了HRLL 水提物降糖效應(yīng)評(píng)價(jià)，為HRLL 健康茶飲開發(fā)提供基礎(chǔ)信息。

研究發(fā)現(xiàn)，5 dpf 斑馬魚對(duì)高濃度的HRLL 水提物具有不耐受性， 孵育 24 h 時(shí)的 LC50為2479.41 μg/mL，在安全劑量范圍內(nèi)的研究結(jié)果表明，200、400 和 800 μg/mL HRLL 均具有明確的降糖作用，且降糖效應(yīng)呈一定的劑量依賴，推測與其內(nèi)含的功能活性物質(zhì)有關(guān)。 HRLL 中含有沙棘蛋白、黃酮類、多酚類、三萜和甾體類化合物等多種功能活性成分[15-17]，尤其是含有科羅索酸，有“植物中的胰島素”[18]之稱，HRLL 中約含有0.055%科羅索酸[18]。 田曉東[18]以 HRLL 為原料提取制備了含有2.14%科羅索酸的HRLL 粗提物，發(fā)現(xiàn) 0.94 和1.88 g/kg HRLL 粗提物和 20 mg/kg科羅索酸處理可以顯著降低糖尿病大鼠的血糖，顯著增強(qiáng)肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性，其降糖機(jī)制可能與提升機(jī)體的抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基進(jìn)而保護(hù)胰腺和肝臟等器官有關(guān)。 張璐[19]研究發(fā)現(xiàn)含三萜酸沙棘粗提物（內(nèi)含2.14%的科羅索酸）可以顯著降低大鼠空腹血糖、 改善糖耐量及胰島素抵抗。另外，沙棘蛋白和沙棘黃酮也具有一定的降糖作用。 劉洪霞等[20]研究發(fā)現(xiàn)以50 mg/kg 沙棘蛋白連續(xù)灌胃8 周可以顯著降低2 型糖尿病模型db/db小鼠血糖。 舒丹陽等[21]研究發(fā)現(xiàn)以 50、150 和250 mg/kg/d 沙棘籽蛋白肽連續(xù)灌胃8 周，可以顯著降低2 型糖尿病小鼠血糖水平。 楊闊[22]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，50~200 μg/mL 沙棘黃酮可以顯著促進(jìn)分化成熟的3T3-L1 脂肪細(xì)胞和C2C12 骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。 沙棘黃酮可以激活上述兩種細(xì)胞內(nèi)的AMP 依賴的蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路，上調(diào)p-AMPK 的蛋白表達(dá)水平， 促進(jìn) GLUT4 蛋白轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上， 抑制PPARγ 及其磷酸化蛋白的表達(dá)，表明沙棘黃酮通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。

相較于大小鼠功能評(píng)價(jià)體系， 試驗(yàn)采用的5 dpf 斑馬魚評(píng)價(jià)技術(shù)具有孵育喂養(yǎng)（飼養(yǎng)）時(shí)間短，誘導(dǎo)24 h 建模具有實(shí)驗(yàn)周期短，采用多孔板操作實(shí)驗(yàn)便捷等特點(diǎn)，不僅可以有效節(jié)約成本，還可以有效縮短試驗(yàn)周期。 此外研究借鑒日常茶葉泡飲法，重點(diǎn)研究HRLL 全浸出物的實(shí)際功效評(píng)價(jià)，采用的斑馬魚高通量篩選模型是可以快速、 準(zhǔn)確篩選最優(yōu)作用劑量濃度的最佳方案， 也為下一步最優(yōu)劑量優(yōu)選提供了基礎(chǔ)和參考信息。

4 結(jié)論

5 dpf 斑馬魚對(duì)高濃度的HRLL 具有不耐受性， 孵育 24 h 時(shí)的 HRLL 的 LC50為 2479.41 μg/mL，95%可信范圍為 2081.20~3034.93 μg/mL。 按照10%~25% LC50劑量濃度推薦并略作調(diào)整，選用 200、400 和 800 μg/mL HRLL 開展了基于正常生理的和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型的降糖作用評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在10 mg/mL GLU 誘導(dǎo)斑馬魚模型中，200、400 和 800 μg/mL HRLL 處理斑馬魚 GLU 值分別降低了 33.06%（p＜0.05）、37.54%（p＜0.05）和 54.29%（p＜0.05）；在 10 mg/mL GLU 和0.025 mM ALX 誘導(dǎo)的糖尿病斑馬魚模型中，200、400 和 800 μg/mL HRLL 處理組斑馬魚GLU 值分別降低了 42.22%（p＜0.05）、64.47%（p＜0.05）和 59.49%（p＜0.05）。 結(jié)果表明，基于斑馬魚生物模型評(píng)價(jià)，200、400 和 800 μg/mL HRLL 具有明確的降糖作用。 下一步還將繼續(xù)開展構(gòu)建基于穩(wěn)定可靠的斑馬魚模型，開展毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)和劑量學(xué)估算研究，開展降糖作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制研究。 我國是中藥材資源型大國，很多藥用植物在系統(tǒng)功能上具有協(xié)同效應(yīng)，還需進(jìn)一步開展以HRLL 為核心的組方配伍研究及功能評(píng)價(jià)研究，開發(fā)具有輔助降糖效應(yīng)的健康茶飲產(chǎn)品。