李晨芹，李軍喬*，王鑫慈，牛永昆，曲俊儒

（1.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海 西寧 810000；2.青海民族大學(xué)青藏高原蕨麻研究中心，青海 西寧 810000；3.青海省特色經(jīng)濟(jì)植物高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810000）

青藏高原（Qinghai-Tibetan Plateau，QTP）是世界上最高（海拔4000 m以上）和最大的高原（約2.5×106km2），部分青藏高原植物在其高海拔、低溫、晝夜溫差大、缺氧、干旱、土壤貧瘠、強(qiáng)紫外輻射等獨(dú)特環(huán)境中長(zhǎng)期進(jìn)化而成為青藏高原的特有資源［1-2］。蕨麻（Potentilla anserina）為薔薇科（Rosacrae）委陵菜屬（Potentilla）多年生匍匐草本植物，是青藏高原特有的植物資源，在青海、西藏、甘肅等高寒地區(qū)均有分布，且僅在青藏高原等高寒地區(qū)根系膨大形成塊根［3-4］。蕨麻富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，當(dāng)?shù)匾云鋲K根入藥，具有一定的藥用、食用及生態(tài)價(jià)值［3］。近年來(lái)眾多學(xué)者對(duì)蕨麻展開(kāi)了種質(zhì)資源、栽培管理技術(shù)、主效活性成分分析和藥理作用的研究，蕨麻人工種植技術(shù)也在不斷更新，其市場(chǎng)價(jià)值與發(fā)展前景日漸趨顯［4-8］。蕨麻人工栽培規(guī)模在不斷擴(kuò)大，已審定的3個(gè)品種在青海、甘肅等地區(qū)推廣種植累計(jì)約6.67×103hm2，而其帶動(dòng)的產(chǎn)業(yè)是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的新興生態(tài)產(chǎn)業(yè)。但在青藏高原“暖濕化”的背景下，隨著蕨麻種植面積的擴(kuò)大和單一品種連作年限的遞增，近年來(lái)田間種植的蕨麻也不斷出現(xiàn)塊根腐敗和黑斑的癥狀，直接影響到蕨麻的產(chǎn)量與質(zhì)量發(fā)展［9-10］。病原微生物的繁殖與傳播是根腐病發(fā)生的重要原因，而不同地區(qū)不同植物根腐病的癥狀因病原物的不同而有所差異［11-12］。大量研究表明根腐病的病原復(fù)雜，真菌侵染是病害發(fā)生的主要原因，且多與鐮刀菌有關(guān)，癥狀多體現(xiàn)為被侵染植株生長(zhǎng)緩慢且莖葉枯萎變黃，根部腐爛壞死［13-14］。但當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚未出現(xiàn)對(duì)蕨麻病害的相關(guān)研究，為此探究蕨麻根腐病病原菌及其生物學(xué)特性對(duì)蕨麻人工種植地區(qū)病害的預(yù)防和控制具有一定的理論研究?jī)r(jià)值和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

本試驗(yàn)對(duì)從蕨麻根部分離獲得的一株蕨麻根腐病菌——鐮刀菌Fusarium perseae進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，包括對(duì)其的分離鑒定及生物學(xué)特性研究，以期為今后蕨麻根腐病的診斷和防治提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌及回接植物材料

試驗(yàn)病原菌為本實(shí)驗(yàn)室2020年從青海省湟源縣蕨麻人工種植基地蕨麻（蕨麻5號(hào)）根腐病發(fā)病部位采用方中達(dá)［15］和Qiu等［16］的組織分離法分離所得的一株單孢菌株?；亟又参锊牧蠟?020年從青海省湟源縣蕨麻人工種植基地采挖帶回實(shí)驗(yàn)室的蕨麻（蕨麻5號(hào)）塊根。

1.2 病原菌的致病性檢測(cè)

離體回接檢測(cè)：采用離體根部接種法進(jìn)行離體回接致病性檢測(cè)［15］。將單孢菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）上25℃黑暗培養(yǎng)7 d至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿。挑選出大小一致、健康且無(wú)病害的蕨麻塊根用流水沖洗，再進(jìn)行充分消毒處理（用75%酒精浸泡1 min，再用現(xiàn)配3.75%活性次氯酸鈉溶液浸泡6 min，然后75%酒精處理0.5 min后用無(wú)菌水清洗4次備用）后對(duì)其根部進(jìn)行刺傷處理。用打孔器打好直徑為5 mm的菌餅，將其覆蓋在蕨麻塊根刺傷部位，置于鋪有兩層用無(wú)菌水潤(rùn)濕的濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿3個(gè)，3次重復(fù)，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，直至形成明顯病斑后再次分離培養(yǎng)，觀(guān)察分離所得菌株，從而判斷其與接種的菌株是否為同一株病原菌。

活體回接檢測(cè)：篩選出大小一致、健康且無(wú)病害的蕨麻塊根進(jìn)行消毒處理（消毒方法同離體回接中使用的方法），將其培養(yǎng)成健康植株。配制病原菌株孢子懸浮液（濃度約1×106·mL-1），將其根灌于根部已刺傷處理的蕨麻植株，3次重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照，持續(xù)觀(guān)察其生長(zhǎng)狀況直至其形成典型癥狀，從發(fā)病部位再次進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，觀(guān)察所得菌株，從而判斷其與接種的菌株是否為同一株病原菌。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1病原菌的形態(tài)學(xué)特征 將菌株接種于PDA平板上25℃暗培養(yǎng)7 d，觀(guān)察菌落顏色、形狀等特征。菌株產(chǎn)孢后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察其菌絲、孢子形態(tài)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行病原菌形態(tài)學(xué)鑒定［17-18］。

1.3.2病原菌分子生物學(xué)鑒定 收集D2菌的菌絲體，采用北京博友順生物技術(shù)有限公司提供的自產(chǎn)DNA提取試劑盒提取病原菌DNA（操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），以提取的DNA作為PCR模板，引物為真菌ITS1/ITS4通用引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖檢測(cè)后由北京博友順生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA軟件中的Neighbor Joining（NJ）程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 病原菌生物學(xué)特性研究

1.4.1不同條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 1）不同溫度、光照及pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響：將菌株置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅若干，接種于PDA培養(yǎng)基上，分別在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)：置于5、10、15、20、25、30、35℃共7個(gè)溫度梯度恒溫黑暗培養(yǎng)；置于連續(xù)光照（light，L）、12 h光暗交替（1/2L）、連續(xù)黑暗（dark，D）共3種處理下25℃恒溫培養(yǎng)；置于p H值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的培養(yǎng)基共10個(gè)pH梯度恒溫黑暗培養(yǎng)，5 d后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑并記錄菌落生長(zhǎng)狀況。7 d后取每皿4塊直徑為5 mm的菌餅，用1 mL無(wú)菌水洗脫孢子，進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板孢子計(jì)數(shù)，3次重復(fù)。

2）不同碳源、氮源、培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響：將菌株置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)5 d，用無(wú)菌打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅若干，分別接種于不同條件的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)：以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于不同碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)，碳源分別為C1（缺碳對(duì)照）、C2（葡萄糖）、C3（蔗糖）、C4（乳糖）、C5（可溶性淀粉）、C6（果糖）、C7（甘露醇）共7種處理；以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于不同氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)，氮源分別為N1（缺氮對(duì)照）、N2（甘氨酸）、N3（磷酸二氫銨）、N4（硝酸銨）、N5（硫酸銨）、N6（蛋白胨）、N7（牛肉浸膏）、N8（硝酸鈉）共8種處理；置于不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別為蕨麻煎汁培養(yǎng)基（JM）、添加葡萄糖作為碳源的蕨麻煎汁培養(yǎng)基（JMC）、添加硝酸鈉作為氮源的蕨麻煎汁培養(yǎng)基（JMN）、LB培養(yǎng)基（LB）、PDA培養(yǎng)基（PDA）和Czapek培養(yǎng)基（CZ），于25℃黑暗培養(yǎng)，5 d后采取十字交叉法測(cè)量菌落直徑并記錄菌落生長(zhǎng)狀況。7 d后取每皿4塊直徑為5mm的菌餅，用1 mL無(wú)菌水洗脫孢子，進(jìn)行血球計(jì)數(shù)板孢子計(jì)數(shù)，3次重復(fù)。

1.4.2菌絲致死溫度測(cè)定 將直徑為5 mm的菌餅分別置于裝有5 mL無(wú)菌水的試管中，將試管分別置于40、45、50、55、60、65、70℃的恒溫水浴鍋中，水浴10 min后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基，于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，3次重復(fù)，觀(guān)察菌絲生長(zhǎng)，確定致死溫度范圍，再按1℃溫度梯度進(jìn)行上述處理確定最終的菌絲致死溫度。

1.4.3不同條件對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的影響 1）分生孢子萌發(fā)時(shí)間的測(cè)定：配制濃度為10～20個(gè)孢子·視野-1（10×40倍）的分生孢子懸浮液進(jìn)行分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)，25℃保濕培養(yǎng)，在0～60 h（間隔4 h）檢查孢子萌發(fā)情況，測(cè)定孢子萌發(fā)率（隨機(jī)檢測(cè)100個(gè)孢子萌發(fā)情況）確定最佳萌發(fā)時(shí)間。

2）不同溫度、光照及pH值對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響：將分生孢子置于不同的溫度、光照及pH值的條件下進(jìn)行分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)（所用培養(yǎng)基為PDA液體培養(yǎng)基），各處理同1.4.1，于最佳萌發(fā)時(shí)間（試驗(yàn)測(cè)得為48 h）后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

3）不同碳源、氮源、培養(yǎng)液對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響：將分生孢子置于不同碳源、氮源、培養(yǎng)基條件下進(jìn)行分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)（所用培養(yǎng)基均為對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基），各處理同1.4.1，于最佳萌發(fā)時(shí)間（48 h）后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（采用Duncan新復(fù)極差法），試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

蕨麻根腐病的發(fā)病部位主要為蕨麻的根部。植物在發(fā)病初期地上部分變化不明顯，部分莖葉表現(xiàn)為枯萎變黃，根部出現(xiàn)明顯的黑褐色病斑。隨著病情加重，蕨麻根部褐變明顯、受害面積增大，甚至出現(xiàn)軟化、腐爛現(xiàn)象。后期植株莖葉枯萎變黃加重，地下部分可見(jiàn)白色菌絲附著，根部腐爛壞死（圖1）。

圖1 蕨麻根腐病癥狀Fig.1 P.anserina root rot symptoms

2.2 病原菌的分離與致病性檢測(cè)

通過(guò)常規(guī)組織分離法對(duì)發(fā)病蕨麻塊根進(jìn)行分離、單孢純化，得到多株真菌菌株，將培養(yǎng)性狀、菌絲和孢子形態(tài)一致的分離物合并編號(hào)為D2。將菌株D2根據(jù)柯赫氏法則分別接種于離體根部和活體盆栽蕨麻植株上，觀(guān)察并記錄發(fā)病情況。將菌株D2接種到離體的蕨麻塊根上，與對(duì)照相比有傷口和無(wú)傷口的蕨麻塊根均具有發(fā)病癥狀，產(chǎn)生褐色病斑，長(zhǎng)出致密的白色菌絲，塊根出現(xiàn)腐爛跡象（圖2）。將菌株D2接種在盆栽蕨麻植株上，7～15 d后植株染病出現(xiàn)萎蔫變黃現(xiàn)象，根莖處密集菌絲，塊根處有黑褐色斑點(diǎn)，發(fā)病癥狀與田間相似，對(duì)照不發(fā)?。▓D3）。對(duì)離體和活體回接后發(fā)病病樣的病斑與健康部位交界處再次分離，獲得與原接種分離物一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則可以確定菌株D2為蕨麻根腐病的病原菌。

圖2 菌株D2致病性測(cè)定結(jié)果（離體回接）Fig.2 Pathogenicity determination results of strains D2（in vitro inoculation）

圖3 菌株D2致病性測(cè)定結(jié)果（活體回接）Fig.3 Pathogenicity determination results of strains D2（in vivo inoculation）

2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

D2菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，5 d可長(zhǎng)滿(mǎn)全皿。菌落正面為白色絲絨狀，基物為肉粉色（圖4a和b）。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，D2菌絲為有隔菌絲，直徑為4.0～5.0μm（圖4c）。單瓶梗產(chǎn)孢，分生孢子梗樹(shù)枝狀（圖4d）。大型分生孢子呈鐮刀形，中部細(xì)胞寬頂胞漸尖，大小為14.9～30.0μm×4.2～5.3μm（圖4e）。小型分生孢子多為單細(xì)胞，橢圓形（圖4f）。厚垣孢子間生于菌絲之間，多為串生球形，直徑4.5～8.7μm（圖4g）。根據(jù)病原菌的菌落特征、分生孢子及厚垣孢子的形態(tài)特征，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料，初步確定D2為鐮刀菌屬的真菌。

圖4 菌株D2在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.4 Colony and microscopic mor phologies of D2 on PDA medium

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用引物ITS1/ITS4對(duì)菌株D2進(jìn)行特異性擴(kuò)增，在約500 bp處有特異性片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的序列經(jīng)BLAST比對(duì)分析，選取相似性較高的序列用MEGA（5.10）軟件的Neighbor Joining程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，置信度（Bootstrap）經(jīng)1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)構(gòu)建的聚類(lèi)樹(shù)。結(jié)果顯示，該病原菌與F.perseae（NR 164415.1）聚在一起，遺傳距離最近，親緣關(guān)系密切（圖5）。結(jié)合前期的形態(tài)學(xué)特征，綜合分析鑒定該病原菌為F.perseae。

圖5 菌株D2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of D2

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1不同條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 1）不同溫度、光照及pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 D2菌絲對(duì)溫度（圖6A）的適應(yīng)范圍較廣，菌絲和產(chǎn)孢范圍均在5～35℃。菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25℃，5 d菌落直徑為5.28 cm；最適產(chǎn)孢溫度為30℃，7 d產(chǎn)孢量為6.10×107·mL-1；低于5℃菌絲基本不生長(zhǎng)，低于15℃產(chǎn)孢量也極少。光照（圖6B）對(duì)D2菌株生長(zhǎng)具有一定的影響，菌絲在黑暗條件下生長(zhǎng)最快，12 h光暗交替利于菌落產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量達(dá)8.82×107·mL-1。D2菌絲在pH 3.0～12.0內(nèi)均可生長(zhǎng)（圖6C）且生長(zhǎng)狀況良好，在pH值為7.0時(shí)菌落直徑達(dá)最大值，為5.13 cm，在pH值為3.0時(shí)菌落直徑達(dá)最小值，為1.88 cm。在p H 3.0～12.0，D2產(chǎn)孢量曲線(xiàn)呈單峰型，隨pH值的增大而先增后減，在pH值為9.0時(shí)達(dá)到峰值（5.02×107·mL-1）。

圖6 不同生物學(xué)特性對(duì)菌株D2菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Fig.6 Effects of different biological characteristics on mycelium growth and sporulation of strain D2

2）不同碳源、氮源和培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響：D2菌株能利用多種碳源、氮源，且在多種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)并產(chǎn)孢，部分培養(yǎng)基可以使菌絲體產(chǎn)生具有一定差異的顏色。

供試碳源（表1和圖7）以C2（葡萄糖）最為適合菌絲生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速率和豐度都是最佳的；其次是C7（甘露醇）、C3（蔗糖）和C6（果糖）；C5（可溶性淀粉）菌絲生長(zhǎng)速率較高但菌絲豐度低，C4（乳糖）不利于菌絲生長(zhǎng)。其中，以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲體呈草綠色，以可溶性淀粉為碳源的菌絲為深綠色，以蔗糖和甘露醇為碳源的菌絲為墨綠色。供試碳源都顯著利于D2產(chǎn)孢，其中以C6（果糖）最顯著，產(chǎn)孢量達(dá)2.63×107·mL-1，其 次 是C5（可 溶 性 淀 粉）和C3（蔗糖）。因此可推測(cè)鐮刀菌D2侵入蕨麻植株能利用其體內(nèi)的光合產(chǎn)物進(jìn)行生長(zhǎng)與繁殖。

圖7 菌株D2在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.7 Colony morphologies of D2 on different carbon source medium

表1 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響Table 1 Effects of different carbon source on mycelium growth and spor ulation

供試氮源（表2和圖8）以N8（硝酸鈉）、N2（甘氨酸）和N7（牛肉浸膏）適合菌絲生長(zhǎng)，而N5（硫酸銨）、N4（硝酸銨）和N3（磷酸二氫銨）不利于菌絲生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速率受到顯著抑制。菌絲在供試氮源培養(yǎng)基上均較為致密，其中以N2（甘氨酸）和N7（牛肉浸膏）為氮源生長(zhǎng)的菌絲體呈現(xiàn)為墨綠色。供試氮源利于D2產(chǎn)孢，其中以N5（硫酸銨）最顯著，產(chǎn)孢量達(dá)3.2×107·mL-1，其次是N7（牛肉浸膏）和N3（磷酸二氫銨）。因此，在氮源的利用方面，D2菌株的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)為對(duì)有機(jī)氮和硝態(tài)氮的有效利用更好，而對(duì)銨態(tài)氮的利用則更利于其產(chǎn)孢。

圖8 菌株D2在不同氮源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.8 Colony morphologies of D2 on different nitrogen source medium

表2 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響Table 2 Effects of different nitrogen source on mycelium gr owth and sporulation

供試培養(yǎng)基（表3）中D2在JMC和PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況均顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基，菌落直徑分別可達(dá)5.18和5.28 cm，產(chǎn)孢量分別為3.53×107和3.52×107·mL-1。CZ培養(yǎng)基對(duì)D2菌絲生長(zhǎng)速率的影響與JMC和PDA培養(yǎng)基并無(wú)顯著差異，但產(chǎn)孢量卻顯著減少。

表3 培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響Table 3 Effects of medium on mycelium growth and sporulation

2.5.2菌絲致死溫度測(cè)定 D2菌絲在35～60℃恒溫水浴10 min后能在PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，當(dāng)溫度條件高于65℃后不能生長(zhǎng)，初步確定D2菌絲致死溫度為60～65℃。在60～65℃以1℃為梯度設(shè)置6個(gè)溫度梯度繼續(xù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示菌絲在60～63℃仍可生長(zhǎng)，64和65℃水浴處理10 min后的D2菌絲不能生長(zhǎng)，因此可確定D2致病菌的菌絲致死溫度為64℃，10 min（圖9）。

圖9 菌絲致死溫度Fig.9 Fatal temperature of mycelium

2.5.3不同條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響 1）分生孢子萌發(fā)時(shí)間測(cè)定：經(jīng)60 h的連續(xù)觀(guān)察記錄發(fā)現(xiàn)D2孢子從4 h后開(kāi)始萌發(fā)，48 h后孢子萌發(fā)達(dá)到峰值且趨于穩(wěn)定，之后系列分生孢子萌發(fā)相關(guān)試驗(yàn)均以此為基礎(chǔ)進(jìn)行（圖10）。

2）不同溫度、光照及pH值對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響：D2菌株的孢子萌發(fā)的溫度范圍為10～35℃，孢子萌發(fā)率曲線(xiàn)呈單峰型，隨溫度的增大而先增后減，在溫度為25℃時(shí)達(dá)到峰值，為95.33%，在30～35℃孢子萌發(fā)率較低（低于30%）（圖10）。光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響差異顯著（P＜0.05），其中12 h光暗交替不利于孢子萌發(fā)（孢子萌發(fā)率為48.67%），其次是全光照條件下孢子萌發(fā)率為60.67%，表明光照條件不宜于D2菌株的分生孢子萌發(fā)。在pH 3.0～12.0內(nèi)D2菌株孢子均可萌發(fā)，但不同pH值條件對(duì)孢子萌發(fā)率的影響差異顯著，其中最適pH值為7.0，在pH值為3.0和4.0時(shí)，孢子萌發(fā)率較低，約為20%。

3）不同碳源、氮源和培養(yǎng)液對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響：供試碳源、氮源對(duì)D2菌株孢子萌發(fā)的影響具有一定差異（圖10E和F）。C4（乳糖）和C6（果糖）促進(jìn)孢子萌發(fā)，且效果顯著高于其他供試碳源，其次為C5（可溶性淀粉）、C7（甘露醇）和C2（葡萄糖），C3（蔗糖）對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)顯著促進(jìn)效果。N2（甘氨酸）、N7（牛肉浸膏）和N6（蛋白胨）促進(jìn)孢子萌發(fā)，且效果顯著高于N3（磷酸二氫銨）、N4（硝酸銨）和N5（硫酸銨），而N8（硝酸鈉）對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)顯著促進(jìn)效果，說(shuō)明有機(jī)氮利于其孢子萌發(fā)。6種培養(yǎng)液中PDA能顯著促進(jìn)D2菌株孢子萌發(fā)，萌發(fā)率在48 h達(dá)95.33%；其次是JMC，萌發(fā)率為73.33%；LB、JMN和JM培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率均在40%～60%；CZ培養(yǎng)的孢子萌發(fā)率在48 h僅為1.67%，幾乎不萌發(fā)（圖10 G）。

圖10 不同生物學(xué)特性對(duì)菌株D2孢子萌發(fā)的影響Fig.10 Effects of different biological characteristics on spore germination of strain D2

3 討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和致病性驗(yàn)證方法鑒定出一株引起蕨麻根腐病的鐮刀屬病原真菌（F.perseae）。該真菌于2020年由Kerry等［19］基于系統(tǒng)基因組學(xué)等將Neocosmospora perseae更名為F.perseae。Miettinen等［20］在2018年報(bào)道N.perseae能引起意大利梨樹(shù)潰瘍病，其余均未見(jiàn)報(bào)道。致病性研究發(fā)現(xiàn)人工接種供試菌株D2后蕨麻發(fā)病癥狀與蕨麻根腐病田間癥狀一致，且該菌株致病力較強(qiáng)，在蕨麻非損傷情況下亦可侵染。目前對(duì)鐮刀菌屬真菌引起植物根腐病的研究較多，青藏高原地區(qū)普遍種植的紫花苜蓿（Medicago sativa）及三七（Panax notoginseng）等根莖類(lèi)藥用經(jīng)濟(jì)作物均有大量報(bào)道根腐病受害嚴(yán)重，其易傳染、難防治的特性給作物栽培田間管理帶來(lái)巨大的壓力［21-23］。

除此之外，本研究對(duì)該菌株也進(jìn)行了較為系統(tǒng)的生物學(xué)特性研究，不同的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)其生長(zhǎng)影響具有一定差異性，菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率、菌絲豐度、色素沉積、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)等都與菌株離體培養(yǎng)條件密切相關(guān)。鐮刀菌對(duì)寄主植物的侵染受到外部環(huán)境條件的影響，適宜的環(huán)境促進(jìn)病原菌菌絲的生長(zhǎng)及孢子的萌發(fā)，利于其侵染寄主植物［12］。研究表明，D2菌株對(duì)環(huán)境條件有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可耐高低溫、酸堿，能利用多種碳源、氮源。D2菌株尤其適于25～30℃生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)，菌絲致死溫度為64℃（10 min），因此可以考慮在蕨麻塊根收獲后采用溫水浸種或高溫愈傷處理阻止病原物對(duì)無(wú)性繁殖體的侵染與危害，避免帶病塊根播種后病害在田間的蔓延。pH能影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶的活性，甚至改變環(huán)境中養(yǎng)料的可給性［24］。該菌的pH適應(yīng)范圍廣，弱堿條件更利于其生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，因此在蕨麻人工種植時(shí)也應(yīng)適當(dāng)?shù)仃P(guān)注田間土壤的酸堿性。鐮刀菌D2侵入蕨麻植株能很好地利用其體內(nèi)的光合產(chǎn)物，對(duì)多種形式的碳源都表現(xiàn)出較好的利用效果。而在氮源利用方面，均表現(xiàn)為能更好地利用有機(jī)氮進(jìn)行生長(zhǎng)與繁殖，菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)為相較于銨態(tài)氮對(duì)硝態(tài)氮的有效利用更好。蕨麻人工種植地與牧民放牧區(qū)重疊度較高，而水肥管理與病害消長(zhǎng)關(guān)系極為密切，因此應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)水肥管理以防止蕨麻根腐病的發(fā)生與蔓延，合理選擇氮肥種類(lèi)，注意田間衛(wèi)生管理，做好蕨麻根腐病的預(yù)防工作。

本研究的鐮刀菌系首次報(bào)道可以侵染蕨麻引起蕨麻根腐病的病原菌。明確了鐮刀菌屬菌株F.perseae引起的蕨麻根部病害的癥狀及其生物學(xué)特性，通過(guò)對(duì)致病菌的分離鑒定及對(duì)其溫度、p H、碳氮源等條件的分析研究，為生產(chǎn)中診斷和防治蕨麻根腐病提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)相關(guān)研究提供了一定的理論參考。根腐病病原復(fù)雜，已有研究發(fā)現(xiàn)部分鐮刀屬真菌病原物具有寄主專(zhuān)化性，該菌株是否具有寄主專(zhuān)化性還需進(jìn)一步研究［25-26］。同時(shí)關(guān)于蕨麻品種抗病性鑒定及大田防治方法等也需進(jìn)一步開(kāi)展研究。眾多研究發(fā)現(xiàn)植物根腐病多數(shù)存在多種病原菌協(xié)同作用導(dǎo)致病害發(fā)生的情況，而鐮刀屬真菌在復(fù)合侵染中通常占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，因此未來(lái)還需擴(kuò)大開(kāi)展對(duì)蕨麻根腐病致病菌的分離鑒定及相互關(guān)系探究等工作［27-28］。