楊德智，王晨，侯明杰，王虎成

（1.慶陽(yáng)市畜牧技術(shù)推廣中心，甘肅 慶陽(yáng) 745000；2.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；3.甘肅民族師范學(xué)院，甘肅 合作 747000）

近些年來(lái)，由于我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展，人們生活水平的提高，以及羊肉所具有的高蛋白、低膽固醇等優(yōu)良特性，對(duì)羊肉的需求量逐年增長(zhǎng)［1］，因此養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展面臨著良好的機(jī)遇，但是傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方式已經(jīng)不能滿足羊肉的消費(fèi)需求。在國(guó)家政策引領(lǐng)和經(jīng)濟(jì)利益調(diào)節(jié)下，養(yǎng)羊業(yè)由傳統(tǒng)的牧區(qū)、半牧區(qū)逐步向飼草資源豐富的農(nóng)區(qū)轉(zhuǎn)移［2-3］。并且隨著肉羊規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖程度的深入，干草、秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品飼料資源因缺乏科學(xué)的開(kāi)發(fā)和處理，沒(méi)有得到合理充分的應(yīng)用［4］。而青貯型飼糧可有效保存飼糧養(yǎng)分、適口性好，是優(yōu)質(zhì)的粗飼料來(lái)源，可有效緩解傳統(tǒng)飼料在飼喂肉羊中存在的問(wèn)題。甜高粱（Sorghum bicolor）原產(chǎn)于非洲，耐干旱、耐貧瘠、飼料轉(zhuǎn)化率高，具有廣泛的用途，是重要的糖料及飼用作物，已在我國(guó)西北地區(qū)得到推廣種植［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)用甜高粱青貯飼喂奶牛，其飼喂效果相當(dāng)于或優(yōu)于玉米（Zea mays）青貯［7］；邰發(fā)紅等［8］用甜高粱青貯和玉米青貯對(duì)比飼喂肉牛，結(jié)果表明甜高粱青貯能滿足肉牛對(duì)優(yōu)質(zhì)飼草的需求，降低成本，增加經(jīng)濟(jì)效益。杜泊羊是原產(chǎn)于南非的一個(gè)肉用綿羊品種，于20世紀(jì)90年代引入我國(guó)，具有抗病力強(qiáng)、耐粗飼、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)［9-10］，是黃土高原丘陵溝壑地區(qū)重要的肉羊品種。由瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃構(gòu)成的前胃是反芻動(dòng)物進(jìn)行物理消化和微生物消化的主要部位。網(wǎng)胃的主要功能是能夠過(guò)濾篩選食入飼料中的異物，并存在其中；瓣胃能夠繼續(xù)磨細(xì)食糜，將較稀的部分輸送到皺胃，并吸收大量的酸和水分。由于前胃樣品收集的難易程度不同，大多數(shù)研究都集中在對(duì)瘤胃微生態(tài)的研究［11-14］，而網(wǎng)胃和瓣胃也是反芻動(dòng)物重要的消化器官，但對(duì)其研究較少，并且以甜高粱青貯為粗飼料在肉羊育肥中的可行性以及對(duì)其健康的影響鮮有報(bào)道，探究甜高粱青貯對(duì)肉羊前胃微生態(tài)的影響，對(duì)進(jìn)一步提高飼料資源的有效利用具有重要的意義。鑒于此，本研究旨在揭示前胃微生態(tài)對(duì)青貯型飼糧的響應(yīng)，為甜高粱青貯育肥肉羊提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼糧

飼用甜高粱青貯料購(gòu)自甘肅省機(jī)械研究院，全株玉米青貯料和苜蓿（Medicago sativa）顆粒購(gòu)自甘肅民祥牧草有限公司，本研究所用飼料的詳細(xì)養(yǎng)分參數(shù)見(jiàn)文獻(xiàn)［15］。其中，飼用全株玉米青貯和甜高粱青貯的干物質(zhì)（dry matter，DM）含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）分別為94.15%和96.92%；粗蛋白（crude protein，CP）含量分別為41.7和37.3 g·kg-1DM；中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量分別為557.0和672.5 g·kg-1DM；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）含量分別為339.0和416.1 g·kg-1DM；木質(zhì)素（lignin）含量分別為19.0和32.2 g·kg-1DM；淀粉含量分別為81.3和18.0 g·kg-1DM。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及其管理

選取3～4月齡杜泊母羊［（33.40±1.68）kg］14只，進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，預(yù)飼期15 d，正試期90 d，共計(jì)105 d。根據(jù)飼喂青貯料的不同，隨機(jī)分為2組，分別為甜高粱青貯組（SS組，甜高粱青貯+試驗(yàn)羊體重1%的精料及0.5%的苜蓿顆粒）和玉米青貯組（CS組，全株玉米青貯+試驗(yàn)羊體重1%的精料及0.5%的苜蓿顆粒），每組7只羊，每只羊?yàn)?個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)羊自由采食并飲水，每天8：00和17：00飼喂兩次，稱(chēng)重記錄給料量和剩料量，并采集飼料樣品，用以測(cè)定和計(jì)算日糧采食量（dry matter intake，DMI），試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)以及試驗(yàn)第30、60和90天對(duì)母羊進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算兩組羊的平均日增重（average daily gain，ADG）和料重比（the ratio of feed to gain，F(xiàn)/G，干物質(zhì)采食量和平均日增重的比值）。

1.3 采樣方法及測(cè)定指標(biāo)

正試期結(jié)束后，每組選取體況相近的4只羊進(jìn)行屠宰，所有羊在屠宰前禁食24 h和禁水2 h，屠宰后分離出消化道，立即將前胃各部分分段并結(jié)扎。用4層紗布過(guò)濾收集瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃內(nèi)容物各2份，用筆式SX620型pH計(jì)測(cè)定pH后，1份置于液氮中，用來(lái)提取前胃微生物DNA；另1份加入HgCl2，保存在-20℃冰箱中，待測(cè)前胃發(fā)酵參數(shù)。取瘤胃背囊，網(wǎng)胃和瓣葉組織去食糜拍照后剪取前胃各部位組織樣品1 cm2（1 cm×1 cm），置于4%的中性福爾馬林固定液中保存固定，用以制作組織切片。

1.3.1前胃發(fā)酵參數(shù) 按照馮宗慈等［16］比色法測(cè)定氨氮（ammonia nitrogen，NH3-N）濃度。按照曾鈺等［17］的方法采用Aglient 6890N氣相色譜儀（色譜柱FFAP30 m×0.32 mm×0.5μ）測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）含量。

1.3.2前胃微生物DNA的提取及測(cè)序 前胃內(nèi)容物微生物DNA的提取利用Omega Stool DNA試劑盒，參照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行提取。細(xì)菌熒光定量引物序列（5′-3′）見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)體系為25μL，包括SYBR?Premix Ex TaqⅡ（Tli RNase H Plus）12.5μL，PCR Forward Primer 1.0μL，PCR Reverse Primer 1.0μL，DNA模板2.0μL，并用雙蒸水（8.5μL）補(bǔ)至終體積為25μL。將PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。

表1 前胃微生物RT-PCR引物Table 1 For estomach microor ganisms RT-PCR pr imer

1.3.3前胃上皮顏色觀察和組織結(jié)構(gòu)測(cè)定 取瘤胃背囊，網(wǎng)胃和瓣葉組織，平鋪后選取3個(gè)不同部位，用國(guó)產(chǎn)精密色差儀（WR-18）測(cè)定亮度，取均值計(jì)算。已固定的前胃組織經(jīng)水洗、酒精脫水、透明、石蠟包埋、冷凍、切片、染色和封片等程序進(jìn)行處理［22］。利用光學(xué)顯微鏡觀察與測(cè)量瘤胃背囊、網(wǎng)胃和瓣胃組織形態(tài)學(xué)，具體包括以下指標(biāo)。瘤胃背囊：乳頭長(zhǎng)度、乳頭寬度、黏膜上皮厚度、黏膜下層厚度和肌層厚度；網(wǎng)胃：黏膜厚度、黏膜下層厚度和肌層厚度；瓣胃：黏膜上皮厚度、中央肌層厚度和瓣葉肌層厚度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010初步整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，然后用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05為差異顯著水平，P＞0.05表示組間無(wú)顯著差異。采用2-△△CT法計(jì)算前胃細(xì)菌的相對(duì)表達(dá)量，對(duì)照為瘤胃各細(xì)菌的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊生長(zhǎng)性能的影響

CS組肉羊的日采食量和平均日增重顯著高于SS組，而料重比顯著低于SS組（表2）。

表2 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of sweet sorghum and whole-plant corn silage on the growth performance of mutton sheep

2.2 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃發(fā)酵參數(shù)的影響

甜高粱青貯和全株玉米青貯育肥肉羊90 d后，對(duì)瘤胃、網(wǎng)胃和瓣胃的p H值未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）。在網(wǎng)胃內(nèi)容物中，SS組肉羊氨氮濃度顯著（P＜0.05）高于CS組，CS組肉羊丁酸含量顯著（P＜0.05）高于SS組。SS組肉羊瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著（P＜0.05）高于CS組（表3）。

表3 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of sweet sor ghum and whole-plant cor n silage on fer mentation parameters of for estomach in mutton sheep

2.3 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃微生物表達(dá)量的影響

SS組肉羊瘤胃內(nèi)短普雷沃氏菌、棲普雷沃氏菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的表達(dá)量顯著（P＜0.05）高于CS組（表4）。SS組肉羊網(wǎng)胃內(nèi)溶纖維丁酸弧菌、棲普雷沃氏菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的表達(dá)量顯著高于CS組（P＜0.05）。CS組肉羊瓣胃內(nèi)短普雷沃氏菌和黃色瘤胃球菌的表達(dá)量顯著高于SS組（P＜0.05），但SS組肉羊瓣胃內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的表達(dá)量顯著高于CS組（P＜0.05）。

表4 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃微生物表達(dá)量的影響Table 4 Effects of sweet sorghum and whole-plant corn silage on microbial expression of forestomach in mutton sheep（%）

2.4 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃上皮顏色的影響

較大的數(shù)值表示上皮顏色較淺，而較小的數(shù)值表示上皮顏色較深（表5）。飼糧處理顯著影響前胃顏色，CS組肉羊的前胃上皮顏色比SS組深（P＜0.05）。

表5 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃上皮顏色的影響Table 5 Effects of sweet sor ghum and whole-plant cor n silage on the color of forestomach epithelium in mutton sheep（亮度L*）

2.5 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃組織結(jié)構(gòu)的影響

SS組肉羊瘤胃乳頭寬度顯著（P＜0.05）高于CS組（表6），甜高粱青貯和玉米青貯對(duì)肉羊網(wǎng)胃黏膜厚度、黏膜下層厚度和肌層厚度并未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05），CS組肉羊的瓣胃黏膜上皮厚度顯著高于SS組（P＜0.05）。

表6 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃組織結(jié)構(gòu)的影響Table 6 Effects of sweet sor ghum and whole-plant cor n silage on the tissue structur e of for estomach in mutton sheep（μm）

3 討論

3.1 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊生長(zhǎng)性能、前胃發(fā)酵參數(shù)和微生物表達(dá)量的影響

Brunette等［23］研究表明，動(dòng)物對(duì)粗纖維含量高的飼糧消化率會(huì)相應(yīng)降低；同樣，張霞等［15］的研究結(jié)果也表明，肉羊?qū)τ衩浊噘A的采食量與甜高粱青貯相比要高，可能是由于甜高粱青貯的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量高，適口性較差，降低了消化率；在本試驗(yàn)中，CS組肉羊的生長(zhǎng)性能指標(biāo)顯著高于SS組，與上述結(jié)果一致。

p H、NH3-N和VFA可以反映前胃內(nèi)環(huán)境發(fā)酵狀況以及飼料的發(fā)酵模式和程度［24］。在本試驗(yàn)中羊的前胃p H變動(dòng)范圍為6.13～7.13，正常范圍為5.5～7.5［25］，說(shuō)明飼喂這兩種青貯料未使肉羊的前胃p H產(chǎn)生異常，與之前的研究結(jié)果一致［26］。氨氮濃度能夠直接反映前胃中微生物的生長(zhǎng)狀況以及微生物對(duì)飼糧蛋白質(zhì)的合成利用，有研究報(bào)道，最適合瘤胃微生物生長(zhǎng)的氨氮范圍為10～50 mg·d L-1［27］，本試驗(yàn)中肉羊的前胃氨氮濃度處在正常波動(dòng)范圍內(nèi)。VFA是反芻動(dòng)物降解日糧中的碳水化合物而產(chǎn)生的，同時(shí)也是重要的能量來(lái)源，能為反芻動(dòng)物提供所需能量的70%～80%［28］。在本研究中，SS組肉羊瘤胃TVFA含量顯著高于CS組，表明甜高粱青貯通過(guò)瘤胃微生物消化后產(chǎn)生了更多的能量物質(zhì)，可能是全株玉米青貯和甜高粱青貯相比淀粉含量（81.3 VS 18.0 g·kg-1DM）較高，在瘤胃內(nèi)迅速發(fā)酵產(chǎn)酸使pH降低，對(duì)某些纖維型碳水化合物的降解產(chǎn)生了抑制［29］。另外在本試驗(yàn)中，SS組肉羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的表達(dá)量顯著高于CS組，這兩種菌均為纖維分解菌，且甜高粱青貯料中性洗滌纖維（672.5 g·kg-1DM）、酸性洗滌纖維（416.1 g·kg-1DM）和木質(zhì)素（32.2 g·kg-1DM）的含量高于全株玉米青貯料中性洗滌纖維（557.0 g·kg-1DM）、酸性洗滌纖維（339.0 g·kg-1DM）和木質(zhì)素（19.0 g·kg-1DM）含量，因此TVFA存在顯著差異。網(wǎng)-瘤胃的節(jié)律性收縮運(yùn)動(dòng)，使瘤胃食糜內(nèi)容物向胃腸道后段推移［30］，本試驗(yàn)中CS組肉羊網(wǎng)胃內(nèi)丁酸含量顯著高于SS組，可能是由于玉米青貯料淀粉含量較高。

反芻動(dòng)物的前胃特別是瘤胃內(nèi)有大量發(fā)酵消化飼糧的微生物，能將飼料消化分解使機(jī)體吸收，對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和動(dòng)物的健康至關(guān)重要［31］。普雷沃氏菌是擬桿菌門(mén)中的普雷沃氏菌屬中重要的淀粉降解菌，能夠?qū)Φ矸?、果膠等非纖維性碳水化合物進(jìn)行降解，但是不能利用纖維素，有些棲普雷沃氏菌對(duì)燕麥（Avena sativa）中的木聚寡糖有很強(qiáng)的降解能力，普雷沃氏菌也是重要的蛋白降解菌，且短普雷沃氏菌的蛋白酶活性最高［28］。在本試驗(yàn)中，甜高粱青貯料粗蛋白含量（37.3 g·kg-1DM）雖然低于全株玉米青貯料（41.7 g·kg-1DM），但是本研究結(jié)果表明SS組肉羊瘤胃內(nèi)短普雷沃氏菌和棲普雷沃氏菌的相對(duì)表達(dá)量顯著高于CS組，暗示可能發(fā)酵所產(chǎn)生的環(huán)境更適合于這兩種蛋白降解菌的生長(zhǎng)。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、瘤胃球菌如白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌等為反芻動(dòng)物前胃內(nèi)主要的纖維降解菌［28］，Thoetkiattikul等［32］研究表明，動(dòng)物采食高纖維飼糧時(shí)的纖維降解菌的表達(dá)量較高。另有研究表明，桑枝（Morus alba）葉粉飼喂云南云嶺牛組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著多于基礎(chǔ)飼糧組［33］。本研究中，SS組肉羊前胃內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的表達(dá)量顯著高于CS組，可能由于這兩種青貯料的粗纖維含量不同所致。

3.2 飼用甜高粱和全株玉米青貯對(duì)肉羊前胃上皮顏色和組織結(jié)構(gòu)的影響

本研究發(fā)現(xiàn)用甜高粱青貯和玉米青貯飼喂肉羊時(shí)，前胃顏色明顯不同，CS組肉羊前胃上皮顏色較深，SS組顏色較淺。有研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃發(fā)酵情況、動(dòng)態(tài)變化、上皮的角質(zhì)化程度以及上皮細(xì)胞健康狀況均能夠通過(guò)反芻動(dòng)物瘤胃上皮顏色得以反映，且會(huì)受日糧礦物質(zhì)組成的影響［34］。當(dāng)反芻動(dòng)物采食高精料飼糧時(shí)，大量產(chǎn)酸，瘤胃上皮細(xì)胞的代謝和增殖速率顯著加快，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)早過(guò)渡到角質(zhì)層，出現(xiàn)瘤胃上皮角化不全的現(xiàn)象［35-36］。Blanco等［37］研究發(fā)現(xiàn)，飼喂精料組美利奴羔羊的瘤胃上皮顏色要比飼喂紫花苜蓿組的顏色深。王龍［38］研究表明，高精料飼糧可導(dǎo)致瘤胃上皮顏色變黑變深。飼喂高能量飼糧比飼喂低能量飼糧時(shí)瘤胃顏色深，可能由于高能量飼糧在瘤胃內(nèi)發(fā)酵迅速，產(chǎn)酸過(guò)多對(duì)上皮的刺激所致［39］；且瓣胃上皮對(duì)丁酸有較強(qiáng)的吸收能力［40］。在本試驗(yàn)中，全株玉米青貯料的淀粉含量（81.3 g·kg-1DM）和甜高粱青貯料（18.0 g·kg-1DM）相比較高，可能會(huì)導(dǎo)致前胃上皮角化不全，因此CS組肉羊前胃上皮顏色較深，而飼喂甜高粱青貯時(shí)，肉羊前胃上皮顏色較淺，更有利于肉羊健康。

反芻動(dòng)物的前胃無(wú)腺體，前胃上皮角化層的厚度、肌層厚度以及黏膜乳頭的特征的改變會(huì)因不同的飼養(yǎng)條件而發(fā)生改變［28］。瘤胃乳頭的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)瘤胃上皮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收以及離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力有決定性作用，且瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度均是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)育程度的重要指標(biāo)［41-42］?？琢顝?qiáng)［43］的研究結(jié)果表明，犢牛瘤胃乳頭的長(zhǎng)度、寬度隨著精料的增加而逐漸增加。于洋等［44］研究放牧與舍飼阿爾巴斯白絨山羊母羊胃腸道組織形態(tài)的變化，結(jié)果表明舍飼育肥組母羊的瘤胃乳頭長(zhǎng)度和寬度顯著高于放牧組。而張雙奇等［45］研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃乳頭長(zhǎng)度與粗飼料的攝入量呈負(fù)相關(guān)，肉羊隨采食精飼料的增加瘤胃乳頭寬度顯著降低。在本試驗(yàn)中用甜高粱青貯和全株玉米青貯料飼喂肉羊90 d后，SS組肉羊的瘤胃乳頭寬度顯著高于CS組，表明甜高粱青貯能夠促進(jìn)肉羊瘤胃的組織形態(tài)發(fā)育，可能與甜高粱青貯中粗纖維和木質(zhì)素等含量高于玉米青貯，與這兩種青貯料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量不同有關(guān)。

此外，在本試驗(yàn)中，CS組肉羊的網(wǎng)胃黏膜厚度、黏膜下層厚度和肌層厚度與SS組相比無(wú)顯著差異，周力等［46］指出，當(dāng)飼糧精料含量較高時(shí)，會(huì)在瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生大量的丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，丁酸含量的不斷增加會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)胃角化不全，不利于網(wǎng)胃的生長(zhǎng)發(fā)育。甄玉國(guó)等［47］研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧粗飼料水平的增加，山羊、綿羊的瓣胃的角化層厚度也相應(yīng)增加，可能與一定水平的粗纖維對(duì)瓣胃的刺激有關(guān)。但本試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米青貯組的瓣胃黏膜上皮厚度的值顯著大于甜高粱青貯組，與前人研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，和飼用玉米青貯相比，飼用甜高粱青貯的肉羊采食量較低，且這兩種青貯料飼喂對(duì)肉羊的微生態(tài)影響，甜高粱青貯組肉羊的瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸含量、前胃內(nèi)纖維分解菌的表達(dá)量以及瘤胃乳頭寬度等指標(biāo)顯著高于玉米青貯組，且甜高粱青貯組肉羊的前胃上皮顏色較淺，角質(zhì)化程度低，有利于肉羊的胃腸道健康。