徐彥文，周婧萱，師科榮

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室,山東泰安 271018）

對于大動物而言，其生殖周期長（世代間隔長）和產(chǎn)仔數(shù)少（繁殖率低），這為優(yōu)質(zhì)大動物群體的擴繁、優(yōu)良品種的培育帶來了不同程度的困難。近年科學(xué)家們提出“干細(xì)胞育種”的理念。胚胎干細(xì)胞 (Embryonic Stem Cells，ESCs) 是一種具有多能性的干細(xì)胞，可分化成多種細(xì)胞、組織和器官，甚至具備發(fā)育成為完整個體的潛能，利用ESCs 進(jìn)行胚胎的體外制備、優(yōu)質(zhì)個體的選育和擴繁是提高大動物育種進(jìn)程的重要有效途徑。但胚胎干細(xì)胞系的建立和獲取是非常困難的，目前僅獲得了鼠、人、猴的胚胎干細(xì)胞系，嚴(yán)重制約了其在大動物上的研究和應(yīng)用。

2006 年提出的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）為多能性干細(xì)胞的獲得打開了一扇新的大門。Takahashi 等首先從24個候選因子中挑出4個因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc，再將這4個基因通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體向小鼠成纖維細(xì)胞共同轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得了類似ESCs 的特征，這類經(jīng)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞被稱為iPSCs，由于這一杰出貢獻(xiàn)Yamanaka 與Gurdon 共同獲得2012 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。經(jīng)典的iPSC 技術(shù)簡單概括為將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 四因子在已經(jīng)分化的體細(xì)胞中過表達(dá)，細(xì)胞發(fā)生重編程、去分化慢慢轉(zhuǎn)變成為具有多能性的干細(xì)胞iPSCs。iPSCs 的成功獲得可以避開胚胎干細(xì)胞建系困難、胚胎來源有限、胚胎移植后發(fā)生的免疫排斥等一系列嚴(yán)重制約多能性干細(xì)胞發(fā)展的瓶頸問題。本文首先對ESCs 和iPSCs 進(jìn)行比較分析，闡述了iPSCs 在大動物育種中的研究進(jìn)展和應(yīng)用策略，深入探討干細(xì)胞育種在大動物生產(chǎn)實踐的重要價值。

1 iPSCs 可以彌補ESCs 來源受限的不足

小鼠ESCs 的建立最早可以追溯到Evans 等從小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（Inner Cell Mass，ICM）中首次成功分離到 ESCs，建立了第1個未分化的小鼠ESCs 系。ESCs 易于基因操作，經(jīng)遺傳改造、顯微操作及冷凍復(fù)蘇后仍然可以保持多能性，因此，ESCs 在大動物育種中有非常廣的應(yīng)用前景。從1981 年以來ESCs 研究從小鼠逐漸擴展到人和其他動物，但僅成功獲得了小鼠、人和猴的ESCs 系。

干細(xì)胞的多能性在大動物育種中的應(yīng)用一直是科學(xué)家探索的熱點，但經(jīng)過30 年的探索大動物ESCs 尚未成功建立和驗證。對于家畜動物，科學(xué)家們在豬ESCs和牛ESCs建系上做了大量嘗試，但都限于“類”ESCs 系的建立。于是，科學(xué)家們開始探索通過其它方式獲得多能干細(xì)胞，2006 年提出的iPSC 技術(shù)為多能性干細(xì)胞的獲得提供可能。iPSCs 是以ESCs 作為參考對象進(jìn)行建立和研究的，因而，iPSCs 和ESCs具有相似的特征或特性，即細(xì)胞形態(tài)相似、基因表達(dá)和表觀遺傳修飾模式相似、可以維持多能性而不分化，同時可以誘導(dǎo)分化形成畸胎瘤、形成嵌合體后代。

不同研究團(tuán)隊研究獲得的iPSCs 出現(xiàn)不同，主要原因可能是iPS 技術(shù)本身是一個隨機性較強的概率事件。體細(xì)胞被重編程誘導(dǎo)的過程中，雖然所有初始細(xì)胞都處于同樣誘導(dǎo)條件和環(huán)境下，只有極少數(shù)細(xì)胞完全重編程。另一方面，不同的iPSCs 系之間也可能存在巨大差異，這種差異在很大程度上源于初始細(xì)胞的遺傳差異、誘導(dǎo)因子及培養(yǎng)條件的不同。

不管iPSCs 和ESCs 的相似程度高或低以及ESCs能否作為評判iPSCs 多能性的標(biāo)準(zhǔn)，不可否認(rèn)的是iPSCs 的誕生是生命科學(xué)研究中的又一個里程碑式的發(fā)現(xiàn)。iPSCs 作為目前唯一不依賴胚胎或卵母細(xì)胞，利用體細(xì)胞進(jìn)行重編程的方式就可以獲得具有多能性細(xì)胞的方法，這一發(fā)現(xiàn)突破了建系困難的技術(shù)瓶頸，將給家畜等大動物育種帶來前所未有的機遇和挑戰(zhàn)。

2 家畜iPSCs 的研究進(jìn)展

近年來科學(xué)家相繼開拓性研究了小鼠、人、豬、綿羊、山羊、馬、牛等物種的iPSCs。經(jīng)過多年的發(fā)展，iPSCs 的誘導(dǎo)方式、誘導(dǎo)效率、細(xì)胞安全性取得了很大進(jìn)步，其應(yīng)用價值和前景也受到廣泛關(guān)注。

值得一提的是，早期研究獲得大動物iPSCs 大多呈primed 態(tài)。隨著誘導(dǎo)分子和培養(yǎng)環(huán)境的不斷摸索，人們進(jìn)一步獲得了naive 態(tài)iPSCs。二者的多能性存在區(qū)別，naive 態(tài)iPSCs 能夠形成嵌合體后代，而primed 態(tài)iPSCs 沒有形成嵌合體后代的能力。

2.1 豬iPSCs 研究進(jìn)展 豬在畜牧業(yè)中占據(jù)重要地位，加之其在器官移植應(yīng)用研究中的優(yōu)勢，一直以來就是大動物ESCs 建系研究的重點。世界上報道的首例豬iPSCs 系是在2009 年，Wu 等利用成纖維細(xì)胞和原代骨髓細(xì)胞為供體細(xì)胞，采用強力霉素（Dox）誘導(dǎo)的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)入人源化6 因子（Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog 和Lin28）進(jìn)行誘導(dǎo)，之后Ezashi 等獲得了人源化5 因子慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)建立的iPSCs。直到2010 年West 等使用人源化6 因子誘導(dǎo)建立的iPSCs 得到嚴(yán)格的全能性驗證，獲得了成活嵌合體。隨后West 等又將獲取的雌性嵌合體豬與正常的雄性野生型豬繁衍，二次獲得了生殖嵌合豬這為轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)，但其結(jié)果的低重復(fù)性是廣泛推廣的一個障礙。Kues 等利用CAG驅(qū)動的Sleeping Beauty 轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒共表達(dá)鼠源4 因子，這種新的轉(zhuǎn)運載體可游離在宿主細(xì)胞基因組之外，整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的頻率很低，可避免病毒重新激活的不安全因素，為生產(chǎn)更加安全的iPSCs 帶來希望。Du 等利用非整合質(zhì)粒episome 瞬時表達(dá)載體誘導(dǎo)系統(tǒng)、且在2i/LIF 的培養(yǎng)體系中獲得了類似于naive 態(tài)iPSCs，通過胚胎注射和胚胎聚合技術(shù)能夠體外形成嵌合比例高的囊胚，但之后的發(fā)育能力受阻。

1997 年誕生的多莉羊不僅證明了終末分化的細(xì)胞核仍具有全能性，也說明體細(xì)胞核移植在家畜動物中取得了歷史性突破。Fan 等通過將由iPSCs 分化而來的細(xì)胞核作為SCNT 的供體細(xì)胞核,分別于2011 年和2012 年成功培育出了多頭體細(xì)胞克隆豬，這也是世界上首次獲得活體iPSCs 來源的克隆豬。還有iPSCs 源克隆豬的報道，其細(xì)胞核大多數(shù)源于可誘導(dǎo)的慢病毒載體生產(chǎn)的iPSCs，這也證明了沉默iPSCs 中外源轉(zhuǎn)錄因子有利于提高克隆豬的生產(chǎn)效率。

目前關(guān)于iPSCs 研究報道有限，值得期待的是iPSCs 能夠通過四倍體囊胚補償實驗獲得克隆動物，這是嚴(yán)格意義上證明iPSCs 具有多能性的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

2.2 馬iPSCs 研究進(jìn)展 2011 年，Nagy 等首次報道利用piggy Bac 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)4 因子將馬成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，然而其多能性的維持依賴于Dox 的誘導(dǎo)。成功建立iPSCs 須滿足外源過表達(dá)基因沉默且多能性基因內(nèi)源激活的條件。2014 年Sharma 等利用馬角化細(xì)胞誘導(dǎo)重編程獲得primed 態(tài)iPSCs。人iPSCs 多數(shù)情況下成纖維細(xì)胞作為誘導(dǎo)重編程的首選源頭細(xì)胞，但是其他類型細(xì)胞（如角化細(xì)胞）更易于重編程，并能更高效生成iPSCs，因此Sharma 等實驗獲得的iPSCs 是角化細(xì)胞作為源頭細(xì)胞的成功嘗試。此外，馬iPSCs 也被首次報道在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下能產(chǎn)生具有膽堿能運動神經(jīng)元特征的細(xì)胞，可產(chǎn)生動作電位。同年，Whitwoth 等利用母馬真皮成纖維細(xì)胞獲得了naive態(tài)iPSCs。

2.3 牛iPSCs 研究進(jìn)展 在所有家畜中，牛ESCs 的研究尤為重要，牛不僅為人類提供大量的優(yōu)質(zhì)乳蛋白/肉類蛋白，更重要的原因是牛的繁殖周期長，并且在自然受孕時一般單胎，所以牛的育種進(jìn)展緩慢是科學(xué)家一直致力攻克的研究熱點。

2011 年Han 等分別利用人源和牛源轉(zhuǎn)錄因子，首次建立了牛iPSCs，其形態(tài)與小鼠的ESCs 相似。牛源6 因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog）體系的誘導(dǎo)效率高于人源體系的誘導(dǎo)效率。Wang 等利用電轉(zhuǎn)染單將Oct4 轉(zhuǎn)入牛生精上皮細(xì)胞誘導(dǎo)獲得表達(dá)SSEA4 的iPSCs，并證明鄰苯二甲酸酯類化合物可誘導(dǎo)iPSCs 發(fā)生凋亡。Talluri 等將轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入牛成纖維細(xì)胞并獲得具有分化為三胚層潛能的iPSCs。Kawaguchi 等用牛羊膜細(xì)胞獲得naive 態(tài)iPSCs，并獲得牛嵌合體。Naive 態(tài)iPSCs 的獲取是干細(xì)胞育種在牛育種中的一個突破。值得一提的是，該naive 態(tài)iPSCs 的獲得源于妊娠50d 的母牛羊膜細(xì)胞，如果未來用母牛產(chǎn)后的羊膜細(xì)胞作為研究對象來建立iPSCs，會更加符合現(xiàn)代干細(xì)胞育種的核心理念。Sumer 等用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染產(chǎn)生iPSCs，并檢測到POU5F1、SOX2、KLF4、c-MYC 和NANOG 的異位表達(dá)，且證明了NANOG 的異位表達(dá)是牛胎成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和維持iPSCs 的必要條件。這與Kawaguchi 等的研究結(jié)果有所差異，其獲得的iPSCs 沒有NANOG 的異位表達(dá)，但可能是bADCs 表達(dá)內(nèi)源性NANOG。因此，NANOG對于iPSCs 的生成與維持的作用值得再推敲。對于牛胚胎干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志及對牛體細(xì)胞重編程機制的深入研究與理解，將為iPSCs 的獲得和建立提供新思路。

2.4 羊iPSCs 研究進(jìn)展 中外科學(xué)家都曾嘗試進(jìn)行綿羊誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立。2011 年，我國兩個團(tuán)隊幾乎同時公布成功建立iPSCs，Bao 等利用 DOX（Doxcycline）誘導(dǎo)的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)異位表達(dá)人源8 因子（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40 LT和 hTERT8），將綿羊耳尖成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs；同年，Li 等在異位表達(dá)鼠源6 因子的情況下將綿羊胎兒成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs。但這兩個研究小組獲得iPSCs 的多能性維持均依賴于DOX 的誘導(dǎo)，這表明iPSCs 可能并不是完全重編程的多能性細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒異位表達(dá)異源4 因子也可以將羊成纖維細(xì)胞重編程，形成的iPSCs 可內(nèi)源表達(dá)多能基因和，但不能持續(xù)維持、未獲得嵌合綿羊。Sartori 等利用經(jīng)典Yamanaka 4 因子將綿羊胎兒成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，分別注射入合子、8 細(xì)胞胚胎、囊胚中可獲得成活的嵌合體后代羊，且嵌合小羊可內(nèi)源表達(dá)嵌合多能因子Oct4。

科研團(tuán)隊也對山羊iPSCs 進(jìn)行了不同程度的探索與研究。2011 年，Ren 等首次報道了4 因子慢病毒表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)的山羊iPSCs，繼而改進(jìn)方法用鼠源6 因子（外加Lin28 和Nanog）、2個人源因子（hTERT8 和SV40 LT）誘導(dǎo)獲得iPSCs，但未能成功獲得向三胚層分化的畸胎瘤。2013 年Song 等再次用慢病毒載體表達(dá)人源4 因子將山羊胎兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs，該細(xì)胞系能內(nèi)源表達(dá)多能性基因，也能體內(nèi)/外分化為三胚層。2015 年，Chu 等研究發(fā)現(xiàn)利用4個人源因子（POU5F1、SOX2、KLF4 和c-MYC）和山羊源蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）可有效提高iPSCs 的誘導(dǎo)生成效率，說明表觀遺傳修飾因子對誘導(dǎo)效率具有調(diào)控功能，但是沒有形成嵌合。同年，Sandmaier 等使用與山羊更接近的牛源因子進(jìn)行誘導(dǎo)重編程，可形成不完全的畸胎瘤。

3 iPSCs 在家畜動物育種中的應(yīng)用途徑和策略

大動物的iPSCs 大多都開展了研究嘗試，有的成功獲得了具有嵌合能力的后代個體。iPSCs 與ESCs 在功能上非常相似，因此在大動物ESCs 系獲得受限的條件下，未來iPSCs 可以作為一種替代性技術(shù)和途徑用于大動物育種（圖1）。另一方面，對所建立 iPSCs 的分析可以反過來促進(jìn)對ESCs 的研究，加速突破構(gòu)建家畜ESCs 系的瓶頸。

圖1 iPSCs 在家畜動物（牛）育種中的潛在應(yīng)用途徑

3.1 iPSCs 提供了建立大動物ESCs 系的一種新途徑在大動物iPSCs 系建立之前，科學(xué)家一直未能成功建立大動物ESCs 系。并且由于對大動物ESCs 的形態(tài)、分子標(biāo)志一直存在爭議，因而建立的ESCs 系被稱為類ESCs。大動物iPSCs 系的成功建立為研究大動物ESCs體外培養(yǎng)所需化學(xué)分子的探索提供了研究平臺，并且，通過對iPSCs 系的分析研究有助于進(jìn)一步明確維持其多能性的生物學(xué)信號通路、揭示鑒定iPSCs 的表面分子標(biāo)志。這些信息都將大力促進(jìn)大動物ESCs 系的成功建立。而ESCs 在家畜育種中的應(yīng)用價值一直被國內(nèi)外科學(xué)家高度關(guān)注。

3.2 iPSCs 用于生產(chǎn)克隆動物或模式動物 iPSCs 是通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體細(xì)胞獲得，源頭細(xì)胞來源廣，較易獲得多能性干細(xì)胞系，這可以彌補大動物ESCs 建系困難的天然缺陷。且iPSCs 只要建系成功便可以無限增殖和傳代，在體外長期冷凍保存。因而，將iPS 技術(shù)與克隆技術(shù)、基因編輯技術(shù)和胚胎技術(shù)相結(jié)合，對于瀕危動物遺傳資源的拯救與保護(hù)、建立保種技術(shù)體系、構(gòu)建模式動物都具有重大的理論意義和實踐意義。

1）誘導(dǎo)分化體外制備生殖細(xì)胞：iPSC 建系是一種新的保種手段，可以作為種質(zhì)資源素材，通過液氮冷凍長期保存。目前我國和日本團(tuán)隊均已成功從ESCs 和iPSCs 中體外培養(yǎng)獲得具有小鼠類卵母細(xì)胞系（Pluripotent Stem Cells Differentiated into PGC-like Cells，PGCLCs)，并且證明可產(chǎn)生后代小鼠。有研究表明，人iPSCs 可以在體外分化為原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ Cell，PGCs），這為體外誘導(dǎo)iPSCs分化產(chǎn)生精子或卵子提供重要啟示。同理，將大動物iPSCs 體外誘導(dǎo)成動物生殖細(xì)胞，通過體外受精對胚胎進(jìn)行性別控制，人為地培育出符合人類生產(chǎn)生活需求特質(zhì)/特性的后代，如通過性別控制提高雌性后代的出生率、縮短動物品種遺傳改良及繁殖的周期，服務(wù)于動物育種與擴繁，有力地推動我國種畜良種推廣工作，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

2）保存珍稀動物的遺傳資源：利用iPSCs 作為供體，結(jié)合克隆技術(shù)生產(chǎn)稀有物種的克隆動物，同時可以迅速擴大瀕危動物的有效群體數(shù)量。

3）突破遠(yuǎn)緣雜交障礙、創(chuàng)造新物種、獲得新性狀：用傳統(tǒng)交配方法無法獲得的新性狀、新物種，用異種來源的iPSCs，結(jié)合核移植或嵌合體制備方法可獲得具有新性狀的克隆動物或異種動物的嵌合體。

4）提高家畜的繁殖效率和育種進(jìn)程：iPSCs 從理論上講可以無限傳代、增殖而不丟失其基因型和表現(xiàn)型。因而，iPS 技術(shù)與胚胎嵌合技術(shù)可生產(chǎn)具有遺傳同質(zhì)型的模式動物，iPS 也可與核移植技術(shù)相結(jié)合可生產(chǎn)克隆動物，大大縮短良種家畜的世代間隔。因而，iPSCs 促進(jìn)良種動物生產(chǎn)潛力的充分發(fā)揮，也可以加速遺傳改良進(jìn)程。

5）提供構(gòu)建模式動物的遺傳素材：iPSCs 結(jié)合核移植技術(shù)可以制備遺傳基礎(chǔ)完全相同的克隆個體，并可進(jìn)行遺傳育種評價，如群體遺傳參數(shù)估計、種質(zhì)鑒定和篩選、個體遺傳評估，還可作為人類疾病模型研究病理機制。

3.3 iPSCs 用于生產(chǎn)基因編輯動物 用iPSCs 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物、基因編輯動物的優(yōu)勢在于打破物種界限，突破親緣關(guān)系。其中iPSCs 最受關(guān)注的特征是其種系嵌合的能力，將iPSCs 注入到宿主囊胚內(nèi)，iPSCs 可以整合到宿主胚胎中參與個體發(fā)育，且具備嵌合到生殖嵴的能力，從而有可能將性狀遺傳給下一代。利用同源重組技術(shù)對iPSCs 進(jìn)行遺傳改造，通過克隆技術(shù)生產(chǎn)遺傳修飾動物，可以改良動物重要經(jīng)濟(jì)性狀、甚至獲得非常規(guī)性狀，如生產(chǎn)人類藥用蛋白、工業(yè)用酶等。

另一方面，iPSCs 細(xì)胞誘導(dǎo)重編程過程本身涉及外源基因的表達(dá)，雖然多能性建立后外源基因沉默，但是可能在重編程過程中激活某些優(yōu)良性狀基因的表達(dá)，產(chǎn)生新的優(yōu)異性狀。通過對優(yōu)秀性狀基因的篩選和鑒定，同時可篩選獲得能夠促進(jìn)重編程效率的基因，從而獲得更加理想的iPSCs 系。

4 展 望

目前，大動物iPSCs 系都已建立，但未見有獲得四倍體囊胚補償?shù)暮蟠?，因而探索各物種穩(wěn)定可控的iPSC 系誘導(dǎo)建立方法依舊任道而重遠(yuǎn)。人iPS 技術(shù)的研究與應(yīng)用依然如火如荼地向前推進(jìn)，有趣的是iPSCs的創(chuàng)始人Yamanaka 于2020 年就iPSCs 在細(xì)胞治療中的應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)發(fā)表了觀點，這些論點都將為大動物iPSCs 的建立及其在干細(xì)胞育種中的應(yīng)用提供更多的理論指導(dǎo)和創(chuàng)新理念。iPSCs 系最初的建立雖然是以ESCs 做為參考對象，但iPSCs 未來的研究和應(yīng)用不完全局限在ESCs 下，僅從iPSCs 的建系不依賴于胚胎、不依賴于卵母細(xì)胞這一個方面就為其在畜牧業(yè)育種的潛在應(yīng)用價值帶來了更多可能性。因此，獲得具有嚴(yán)格意義上多能性iPSCs 系必將為大動物育種增添光彩。