宋世文，宋曉儀，梁 幸，唐淑軍，曾定玲，文冠希

（深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測研究院，廣東 深圳 518101）

β-受體激動(dòng)劑是人工合成的苯乙醇胺類藥物，曾被用于動(dòng)物飼料中以提高飼料的轉(zhuǎn)化率，增加動(dòng)物胴體的瘦肉率［1］。含有β-受體激動(dòng)劑殘留的動(dòng)物性食品引起的食品安全事件已得到社會(huì)廣泛關(guān)注。中國明令禁止在動(dòng)物飼養(yǎng)中使用或在產(chǎn)品中檢出此類藥物［2］。分子印跡技術(shù)（Molecular Imprinting Technology，MIT）作為一項(xiàng)新型技術(shù)，具有與天然生物分子識(shí)別的專一性，同時(shí)又具有良好的穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于樣品前處理過程［2］。

研究通過優(yōu)化分子印跡固相萃?。∕ISPE）上樣、淋洗和洗脫溶劑的選擇等凈化條件及質(zhì)譜條件，建立了快速檢測豬肌肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅等4種β-受體激動(dòng)劑的MISPE-UPLCMS/MS 分析的混合樣品和單樣品方法?；旌蠘悠贩ㄊ抢闷溥x擇性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，采用10 個(gè)單樣品組成混合樣品先進(jìn)行篩選，再對陽性混合樣品進(jìn)行單個(gè)檢測，方法有較低的檢出限和較高的精密度，在陽性率不高時(shí)，能對豬肌肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西馬特羅進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜（美國Waters公司）-QTRAP5500MS 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）、固相萃取裝置、Oasis TM MCX 固相萃取柱（美國Waters 公司）；3-30K 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）；Supel MIP SPE（β-agonists，25 mg/10 mL，65 μm，美國Sigma 公司）；Affinilute MIP-SPE（β-agonist，EU Biotage 公司，25 mg/10 mL）；J2 全自動(dòng)固相萃取濃縮儀（美國J2 SCIENTIFIC 公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck 公司）；甲酸為色譜純（北京迪馬科技有限公司）；乙酸為分析純（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺-N-丙基硅烷吸附劑（PSA），粒徑40～60 μm（美國Agilent Tech）；C18 粉，40 μm（美國Agilent Tech）。克侖特羅（Clenbuterol）、萊克多巴胺（Ractopamine）、沙丁胺醇（Sblbutamol）、西馬特羅（Bambuterol，純度＞98%）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確量取100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容配制1 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液。準(zhǔn)確量取1 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制分別為0.01、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 液相色譜-質(zhì)譜條件

1）色譜柱。Acquity LCBEH C18 柱（50 mm×2.1mm，17 μm，美國Waters 公司）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn) 樣 量5.0～10.0 μL；流動(dòng) 相甲 醇（A）和0.05%（V/V）甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～2.0 min，10%A～40%A，3.0～4.0 min，40%A～90%A；4.0～4.1 min，90%A，4.1～4.2 min，90%A～10%A，4.2～6.0 min，10%A。

2）離子源。電噴霧離子（ESI）源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；電噴霧電壓為正離子5 500 V；離子源溫度500 ℃；霧化氣為60 psi ，輔助加熱氣1為45 psi；輔助加熱氣2為50 psi；氣簾氣30 psi。

1.2.3 樣品準(zhǔn)備

1）單樣品準(zhǔn)備。取有代表性豬肌肉組成樣品300 g，先切成小塊，用高速組織粉碎機(jī)充分粉碎，冷凍備用。

2）混合樣品準(zhǔn)備。將10 個(gè)備用的單樣品，每個(gè)取30.0 g，組成混合樣品，用高速組織粉碎機(jī)充分粉碎，冷凍備用?；旌蠘悠窓z測呈陽性的（≥LOQ），再對10 個(gè)單樣品進(jìn)行檢測。

1.2.4 SPE 柱活化、上樣和洗脫過程

1）MCX 柱。依次用3 mL 甲醇和3 mL 水活化；然后樣品過柱；依次用3 mL 水、3 mL 甲醇水、3 mL甲醇清洗，用洗耳球擠干溶液；5 mL 5%氨水乙醇洗脫，用洗耳球擠干溶液。

2）MISPE 柱。依次用3 mL 乙醇、3 mL 水、3 mL 50 mol/L 乙酸銨（pH 6.7）活化；然后樣品上清液過柱；依次用3 mL 水、3 mL 乙腈、2 mL0.5%乙酸/乙腈溶液淋洗，用洗耳球擠干溶液；用5 mL 10%乙酸/甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用洗耳球擠干溶液。

1.2.5 樣品預(yù)處理 稱5.00 g混合樣（單樣品2.00 g）于50 mL 有蓋離心管，加入10 mL 50 mmol 乙酸銨（pH 6.7），10 000 r/min 勻漿2 min，強(qiáng)烈振蕩5 min，超聲10 min。10 000 r/min 離心6 min，取上清液9 mL，加300 mg PSA 粉和300 mg C18 粉，強(qiáng)烈振蕩3 min，放置5 min，取上清液8 mL 過柱。收集洗脫液，于50 ℃水浴下氮?dú)獯抵两?，?.5 mL 0.1%甲酸水/乙腈復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜，待測。液相色譜進(jìn)樣量混合樣品10 μL（5 μL 單樣品）。SPE 柱活化、上樣、洗脫和濃縮過程也可用J2 全自動(dòng)固相萃取濃縮儀完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

為提高4 種β-受體激動(dòng)劑檢測的選擇性和靈敏度，優(yōu)化檢測離子對的檢測條件，以達(dá)到較好穩(wěn)定性和較高靈敏度的統(tǒng)一，4 種β-受體激動(dòng)劑類藥物的保留時(shí)間及離子對優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4 種β-受體激動(dòng)劑類藥物的保留時(shí)間及離子對質(zhì)譜參數(shù)

2.2 凈化效果比較

提取液組成復(fù)雜，含有脂肪、蛋白質(zhì)和其他有機(jī)物質(zhì)等雜質(zhì)［2］。為提高凈化效果，首先用PSA 粉和C18 粉除去了一部分雜質(zhì)，再用固相柱凈化。比較了Sigma-MIP、Biotage-MIP 與MCX 固相萃取的凈化效果，4 種β-受體激動(dòng)劑在豬肌肉中的添加濃度為0.25 μg/kg，多樣品法測定，重復(fù)6 次，通過固相柱萃取凈化后，應(yīng)用LC-MS 測定，得到4 種β-受體激動(dòng)劑的信噪比（表2）。信噪比高，表示凈化效果好，檢出限低。由表2 可知，Sigma-MIP 固相萃取能有效消除豬肌肉提取液基質(zhì)對4 種β-受體激動(dòng)劑的影響，信噪比最高，其他2 種固相柱只有不到Sigma-MIP 的50%。用變異系數(shù)代表穩(wěn)定性，變異系數(shù)低，表示穩(wěn)定性高；變異系數(shù)高，表示穩(wěn)定性差。由表2可知，Sigma-MIP 固相萃取對4 種β-受體激動(dòng)劑的穩(wěn)定性最優(yōu)，其他2 種在138%和159%以上。綜合上述2 因素，選擇Sigma-MIP 凈化。

表2 3 種固相萃取柱凈化效果的比較

2.3 方法的定量限和線性范圍

單樣品法添加濃度為0.1、0.2、1.0、5.0、10.0 μg/kg；混合樣品法添加濃度為0.025、0.050、0.100、2.000、5.000 μg/kg；其中最低濃度（0.1 和0.025 μg/kg）重復(fù)6 次，其他濃度重復(fù)3 次。由表3 可知，該方法的定量限混合樣品法為0.025 μg/kg，單樣品法為0.1 μg/kg。該方法的定量限較國家標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部公告1025號(hào)［3］，GB/T 22286—2008［4］）定量限LOQ更低，其中單樣品法定量限是國家標(biāo)準(zhǔn)的1/15～1/4。該方法檢定量低，可以作為多樣品混合檢測的依據(jù)。

表3 方法的定量限（與國家標(biāo)準(zhǔn)比較）和線性范圍

2.4 方法的回收率和精密度

單樣品法添加濃度為0.1、0.2、5.0 μg/L；混合樣品法添加濃度為0.025、0.050、2.000 μg/L；每個(gè)梯度重復(fù)6 次。4 種β-受體激動(dòng)劑加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見表4 和表5。不同加標(biāo)濃度下，加標(biāo)回收率為61.3%～97.7%；精密度4.6%～12.6%，方法表現(xiàn)出良好準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

表4 不同添加濃度的單樣品添加回收率和精密度

表5 不同添加濃度的混合樣品添加回收率和精密度

2.5 方法應(yīng)用效率

根據(jù)公開資料［5］，深圳市2019 年畜禽產(chǎn)品1—9月抽檢3 601 個(gè)樣品，檢測β-受體激動(dòng)劑、磺胺、硝基呋喃等4 類20 個(gè)項(xiàng)目，發(fā)現(xiàn)超標(biāo)樣品22 個(gè)，超標(biāo)率0.61%。其中，β-受體激動(dòng)劑超標(biāo)率小于0.1% 。根據(jù)公開信息［6］，2021 年全國抽檢畜禽樣品22 127份，檢測項(xiàng)目18 項(xiàng)，總超標(biāo)率1.2%，β-受體激動(dòng)劑超標(biāo)率小于0.1%。深圳市寶安區(qū)2018—2021 年4年共檢測畜禽產(chǎn)品384 個(gè)，檢測β-受體激動(dòng)劑、磺胺、四環(huán)素類、喹諾酮類等5 類18 個(gè)項(xiàng)目，累計(jì)超標(biāo)樣品15 個(gè)，超標(biāo)率3.9%；超標(biāo)樣品主要是四環(huán)素類和喹諾酮類，未見β-受體激動(dòng)劑類物質(zhì)超標(biāo)。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部監(jiān)測結(jié)果［7］，2017 年第三季度抽檢農(nóng)產(chǎn)品共10 594 個(gè)，β-受體激動(dòng)劑合格率99.8%?？梢姡?受體激動(dòng)劑超標(biāo)率是比較少的，不到0.2%。

在實(shí)際檢測中，對超標(biāo)率小于0.2%的情形，1 000 個(gè)單樣品，可以組成100 個(gè)混合樣品，由于陽性率小于0.2% ，只需2 個(gè)混合樣品重新檢測，所以相當(dāng)于檢測1 000 個(gè)單樣，只需要檢測120 次（100 個(gè)混合樣和20 個(gè)單樣），該方法效率是常規(guī)方法檢測的8.3 倍。對超標(biāo)率小于1%的樣品，100 個(gè)單樣品可以組成10 個(gè)混合樣品，共需檢測20 個(gè)樣品（10 個(gè)混合樣和10 個(gè)單樣品），效率是常規(guī)檢測的5 倍。因此該方法特別適用于超標(biāo)率不高的大量樣品使用，效率是普通方法5～8 倍。