談暠媛，胡 深，周 平，鄭 強(qiáng)，文靜靜，馮超林

（湖北省獸藥監(jiān)察所/湖北省畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，武漢 430070）

中國(guó)寵物相關(guān)行業(yè)發(fā)展迅速，寵物飼料營(yíng)養(yǎng)和質(zhì)量安全受到大眾關(guān)注。牛磺酸是動(dòng)物必須的非蛋白質(zhì)含硫氨基酸，主要以游離狀態(tài)存在于組織間液和細(xì)胞內(nèi)液中［1］，具有豐富多樣的生理功能，在抗氧化，免疫調(diào)節(jié)，抗細(xì)胞衰老方面有顯著的功效［2］，對(duì)于寵物貓十分重要［3-6］。飼料中?；撬岬臋z測(cè)方法主要是高效液相色譜法［7］，缺點(diǎn)是前處理需要衍生，毒性大，操作復(fù)雜，耗時(shí)，影響因素較多。本研究建立了使用氨基酸分析儀檢測(cè)寵物飼料中?；撬岷康姆椒?，利用了牛磺酸水溶性的特點(diǎn)，以水為提取液，經(jīng)離子交換柱層析分離，通過(guò)茚三酮反應(yīng)顯色，用外標(biāo)法定量檢測(cè)出其含量。該方法前處理過(guò)程快速簡(jiǎn)單，不需要衍生，較為適宜貓糧中?；撬岷繙y(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

氨基酸自動(dòng)分析儀L-8900（日本日立）；AE-240電子天平（瑞士梅特勒）；高速冷凍離心機(jī)。

1.2 藥品與試劑

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品（CHEM SERVICE，批號(hào)8103700）；鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；茚三酮顯色溶液（日本和光純藥株式會(huì)社）；氨基酸分析儀配套緩沖液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：精密稱(chēng)取?；撬針?biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，用適量的水溶解，定容至10 mL 容量瓶，配成濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用0.02 mol/L 鹽酸溶液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)條件 離子交換柱，4.6 mm×60.0 mm（填料為離子交換樹(shù)脂，日立2622 sc）；反應(yīng)柱，不銹鋼柱（填料為石英砂，日立855-3533）。交換柱柱溫57 ℃，反應(yīng)柱柱溫136 ℃，緩沖液流速0.4 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm，循環(huán)時(shí)間20 min，采集時(shí)間30 min，進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確量取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別稀釋成1、2、5、10、25、50 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，供儀器分析；進(jìn)樣量為20 μL，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)2 次；取其平均峰面積值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；擬合，求標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.3 樣品的提取 精密稱(chēng)取樣品約1.00 g，置于25 mL 離心管中，加適量水，加熱至60 ℃，超聲提取30 min，用水定容至25 mL。將樣品溶液6 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入0.04 mol/L 鹽酸溶液5 mL，混勻后過(guò)0.22 μm 濾膜。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

在濃度為1～50μg/mL，?；撬岬姆迕娣e與其濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程y=240 590x+23 946，R2=0.999 8。具體見(jiàn)表1、圖1。

圖1 ?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度與峰面積

2.2 儀器精密度

配置牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μg/mL，連續(xù)6 次進(jìn)樣，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.65%。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2 精密度試驗(yàn)

圖2 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品色譜

2.3 定量限和檢測(cè)限

以?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液的色譜響應(yīng)值計(jì)算，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時(shí)，測(cè)得儀器的檢出限為0.15 μg/mL，換算得到方法的檢測(cè)限為7.5 mg/kg；當(dāng)信噪比（S/N）為10 時(shí)，測(cè)得儀器的定量為0.50 μg/mL，方法的定量限為25.0 mg/kg。

2.4 回收率、精密度及空白試驗(yàn)

以貓糧為空白樣品，分別在樣品中添加?；撬徇M(jìn)行回收試驗(yàn)，添加濃度相當(dāng)于50、100、250 mg/g，每個(gè)濃度5 個(gè)平行。結(jié)果見(jiàn)表3、圖3?？梢?jiàn)，使用氨基酸分析儀測(cè)定貓糧中?；撬岷康姆椒ㄝ^為可靠。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果

圖3 空白樣品色譜

2.5 測(cè)定方法分析與驗(yàn)證

以本研究建立的氨基酸分析儀法測(cè)定貓糧中?；撬岷浚ǚ椒?）與用農(nóng)業(yè)部2483 號(hào)公告-5-2016飼料中牛磺酸的測(cè)定-高效液相色譜法（方法2）測(cè)定的結(jié)果相近（表4），說(shuō)明使用氨基酸分析儀測(cè)定貓糧中?；撬岬暮康姆椒?zhǔn)確可靠。

表4 樣品中?；撬岷繙y(cè)定結(jié)果比較 （單位：mg/kg）

由于寵物飼料的特殊性，16 種氨基酸常和?；撬嵬瑫r(shí)存在。試驗(yàn)證實(shí)見(jiàn)圖4，?；撬崤c16 種氨基酸的混標(biāo)可以互不干擾。用氨基酸分析儀測(cè)量?；撬岬耐瑫r(shí)可以測(cè)量氨基酸的含量。通過(guò)氨基酸酸水解的方法處理寵物飼料［8］，可以提取?；撬帷＜訕?biāo)回收試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)?；撬崾褂冒被崴崴獾姆椒ɑ厥章时冉⒌挠盟芙馀；撬岬姆椒ㄒ?。在?；撬岷康偷臉悠分?，本底的影響較大，導(dǎo)致酸水解處理方法的回收率不理想，但是在牛磺酸含量高的樣品中，2 種提取方法結(jié)果相差不大，可以用酸水解法同時(shí)提取樣品中?；撬岷桶被?，用氨基酸分析儀同時(shí)測(cè)量?；撬岷?6 種氨基酸的含量。

圖4 牛磺酸和16 種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)情況

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，氨基酸分析儀可以用于寵物飼料中牛磺酸的含量測(cè)定，該方法比高效液相色譜法測(cè)量省略了衍生的步驟，可直接進(jìn)行測(cè)定，安全無(wú)毒性，減少污染，節(jié)省時(shí)間，操作簡(jiǎn)單。用氨基酸分析儀測(cè)量寵物飼料中?；撬岬姆椒ê?jiǎn)單快速，在濃度為1～50 μg/mL，?；撬岬姆迕娣e與其濃度呈良好的線性關(guān)系。該方法豐富了寵物飼料中?；撬岬暮繙y(cè)定，可為研究寵物飼料中?；撬岬暮刻峁┘夹g(shù)參考。