張麗榮 ，馮 田 ，姚明杰，郭 萍 ，丁 珍 ，孔令保，王 婷

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，a.生物科學(xué)與工程學(xué)院；b.動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045；2.南昌動物病毒與基因工程重點實驗室，南昌 330045；3.武漢科前生物股份有限公司，武漢 430206）

病毒性腹瀉嚴重影響著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟損失。特別是2010 年以來由PEDV 變異株所致的仔豬腹瀉及2014 年發(fā)現(xiàn)的致病性PDCoV，使中國養(yǎng)豬業(yè)面臨新的威脅和挑戰(zhàn)，是關(guān)注的熱點和防控重點［1，2］。PEDV、TGEV、PDCoV 和 GAR 這 4 種病毒是常見典型的豬腸道病毒，均可引起仔豬嘔吐、腹瀉，最后嚴重脫水甚至死亡，其發(fā)病的臨床癥狀相似，難以區(qū)分［3，4］。豬場普遍存在腹瀉病毒的混合感染，并且呈交叉感染。傳統(tǒng)方法造價較高、非特異性強、周期較長難以有效區(qū)分，不適合大規(guī)模的診斷鑒定。因此，建立能夠快速同時檢測致豬腹瀉病毒性病原的方法在臨床上對該病的防控具有重要意義。當(dāng)前，國內(nèi)外已有學(xué)者建立了一些病毒的多重RTPCR 鑒別檢測方法。任玉鵬等［5］建立了 PEDV、TGEV、PDCoV 三重 RT-PCR 方法，但迄今未見同時檢測并區(qū)分 PEDV、TGEV、PDCoV、GAR 多重 RTPCR 方法的報道。本試驗建立了針對PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 4 種腹瀉性病毒的多重RTPCR 檢測方法，并且對該方法條件優(yōu)化后，進行了特異性、敏感性和重復(fù)性分析。同時利用該方法檢測了江西省部分地區(qū)養(yǎng)豬場送來的臨床樣本，驗證該方法的可靠性，以期為獸醫(yī)臨床提供快速診斷和治療的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、乙型腦炎病毒（JEV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬 δ 冠狀病毒（PDCoV）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南昌動物病毒與基因工程重點實驗室保存。非洲豬瘟病毒（ASFV）為自制滅活疫苗。豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病毒三聯(lián)弱毒凍干活疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)公司。

1.2 引物設(shè)計及合成

利用Primer Premier 5.0 分析軟件，根據(jù)Gene-Bank 中登錄的 PEDV（登錄號 MK841495.1）N基因、TGEV（登錄號 KT696544.1）N基因、PDCoV（登錄號MN942260.1）N基因和 GAR（登錄號 JX498961.1）VP7基因序列設(shè)計 4 對引物（表 1），分別擴增 693、557、495 和355 bp 的目的基因片段；引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 多重RT-PCR 引物信息

1.3 病料處理及病毒核酸提取

用PBS 緩沖液將糞便樣品稀釋10 倍，在渦旋儀上振蕩混勻 10 min 后，7 770 r/min 離心 5 min，取上清液用于核酸提??；豬小腸樣品放于EBSS 緩沖液中（10%）振蕩懸浮，7 770 r/min 離心5 min，取上清用于核酸提取。參照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備反轉(zhuǎn)錄cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 單項RT-PCR 退火溫度的確定

采用不同的退火溫度進行PCR 擴增（50.8、51.8、53.2、55.0、56.5 ℃），25 μL 擴增體系中加入模板 2 μL，上下游引物各 1 μL。如圖 1 所示，PEDV 和TGEV 在5 個退火溫度下均能擴增出較亮條帶，PDCoV 和GAR 在不同退火溫度下擴增效率不一，條帶亮度不一。最終確定的退火溫度為51.8 ℃。

圖1 PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 單項RT-PCR 退火溫度的確定

2.2 多重RT-PCR 反應(yīng)條件的確定

在單一RT-PCR 測試5 個退火溫度的基礎(chǔ)上，加入4 種病毒混合cDNA 模板2 μL，每種病毒上下游引物各1 μL 進行PCR 擴增，結(jié)果顯示，與單項PCR 擴增結(jié)果一致，在退火溫度51.8 ℃時擴增效果好，同時在53.2 ℃也可得到較好擴增效果（圖2A）。為確定反應(yīng)體系中引物使用量，在篩選出的2 個退火溫度（51.8 和53.2 ℃）條件下，4 個病毒的引物上下游各加入0.25、0.50、1.00 μL 進行反應(yīng)。經(jīng)方陣試驗確定多重RT-PCR 反應(yīng)最佳體系為2 × RapidTaqMaster Mix 12.5 μL、上 下 游 引 物 各 0.25 μL（10 μmol/L）、模板 2 μL、加滅菌 ddH2O 25 μL。當(dāng)退火溫度為51.8 ℃（圖2B），多重PCR 擴增效果最好。RT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，51.8 ℃15 s，72 ℃ 20 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。

圖2 多重RT-PCR 退火溫度及引物濃度的確定

2.3 多重RT-PCR 敏感性試驗結(jié)果

構(gòu)建4 種病毒目的片段的重組質(zhì)粒。根據(jù)質(zhì)粒拷貝數(shù)（拷貝/μL）=［6.02×1023×質(zhì)粒濃度（ng/μL）×109］/（660×質(zhì)粒堿基數(shù)），換算為拷貝數(shù)。通過換算，PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 質(zhì)?？截悢?shù)分別為8.7×1010、9.8×1010、1.25×1010、1.21×1010拷貝/μL。按照最佳反應(yīng)條件和體系，將上述質(zhì)粒10 倍倍比稀釋液混合后作為模板進行擴增。結(jié)果（圖3）顯示，本試驗建立的多重RT-PCR 方法檢測PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 4 種病毒的最低檢出量分別為8.7、9.8、1 250 和 12.1 拷貝/μL。

圖3 多重RT-PCR 敏感性試驗結(jié)果

2.4 多重RT-PCR 特異性試驗結(jié)果

采用優(yōu)化后的多重RT-PCR 反應(yīng)條件對PEDV、TGEV、PDCoV 和 GAR 混合模板，以及 4 種病毒單一模板進行擴增，同時以常見豬病毒PRRSV、JEV、FMDV、ASFV 的 cDNA 為模板，以及 HCV 的 cDNA 和水為模板設(shè)為對照進行PCR 擴增。結(jié)果如圖4 所示，PRRSV、JEV、FMDV、ASFV 和 HCV 模板擴增后均未見到擴增產(chǎn)物，只有PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 擴增出了相應(yīng)的目的條帶。

圖4 多重RT-PCR 特異性試驗結(jié)果

2.5 多重RT-PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果

以PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 混合模板，以及3 種病毒不同組合混合模板、2 種病毒不同組合混合模板、單一病毒模板進行PCR 重復(fù)檢測，結(jié)果（圖5）顯示，不同組合模板均能擴增得到與預(yù)期大小相符的目的條帶，表明建立的多重RT-PCR方法重復(fù)性好。

圖5 多重RT-PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果

利用建立的多重RT-PCR 以及單一RT-PCR 方法對采自江西某地豬場的30 份臨床樣品進行檢測，圖6 顯示部分臨床樣本的檢測結(jié)果，其中包括5 份小腸樣本和6 份糞便樣本。有2 份小腸樣本和2 份糞便樣本檢測到PEDV。30 份樣本中PEDV、TGEV 和GAR 的陽性檢出率為66.7%、3.3%、6.7%（表2）。多重檢測與單一檢測符合率為100%。表明本研究建立的多重RT-PCR 方法準(zhǔn)確率較高，可以應(yīng)用于臨床樣品的檢測。

圖6 部分臨床樣品多重RT-PCR 檢測結(jié)果

表2 30 份多重RT-PCR 與單一RT-PCR 檢測結(jié)果比較

3 小結(jié)與討論

病毒性疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)，對于病毒核酸的檢測主要是利用PCR 或者RT-PCR 方法。設(shè)計引物時，除了保證引物中的G+C 含量和Tm值符合常規(guī)PCR 的要求外，還要求多條引物的G+C含量盡量保持一致。引物設(shè)計完成后，要在同種病毒的不同毒株之間進行同源性比對，保守性評估，另外還需與其他病毒進行比對以確定設(shè)計的引物是否具有良好的特異性［6，7］。逄鳳嬌等［8］建立的 RT-PCR方法對PDCoV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限為4.05×103拷貝/μL；而本研究中PEDV 最低檢出量為8.7 拷貝/μL。利用建立的多重RT-PCR 方法對來自江西某地豬場的30 份臨床樣本進行檢測，通過與單一PCR 方法以及商品化ELISA 試劑盒檢測方法比較，發(fā)現(xiàn)檢測符合率很高。

本研究建立的多重RT-PCR 方法特異性較強、敏感性較高且檢測快速便捷，可對PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 4 種致豬腹瀉病毒進行鑒別檢測，對豬場流行病學(xué)調(diào)查及相應(yīng)疾病防控具有重要實踐意義，可應(yīng)用于臨床大規(guī)模檢測。