孫 哲 ，張 輝，李澳旋 ，杜曉蓉 ，王永生 ，喬永剛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太谷 030801；3.山西海雪農(nóng)業(yè)科技有限公司，山西 靈石 031300）

黃蜀葵［Abelmoschus manihot（Linn.）Medicus］是錦葵科、秋葵屬一年生或多年生草本植物，又名金花葵，多產(chǎn)于河北、河南、山東等地，較早記錄于《嘉祐本草》［1］。黃蜀葵的花朵不僅觀賞價值高，而且富含金絲桃苷等黃酮化合物以及Fe、Cu、Mn 等微量元素［2］，其具有消炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血脂和清熱解毒等功效［3］。黃蜀葵各部位營養(yǎng)豐富，具有多種維生素及氨基酸，有較高藥用價值和營養(yǎng)價值［4-8］，具有預(yù)防高血壓、高血糖和高脂血癥等作用。

多倍體在自然界普遍存在，隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展和多倍體研究的不斷深入，多倍化已廣泛應(yīng)用于植物進(jìn)化［9］。獲得多倍體植物的主要途徑有物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)等［10，11］，物理誘導(dǎo)多通過射線處理、極端溫度、溫度驟變等方法，但是誘導(dǎo)效率很低，在實(shí)際操作中很少使用；化學(xué)誘變是使用秋水仙素處理正在分裂的細(xì)胞，是加倍效果好、使用廣泛的方法。此外，還有使用離體培養(yǎng)在植物傷口處形成愈傷組織，進(jìn)一步發(fā)育成多倍體的方法［12］。

中國藥用植物資源豐富，栽培歷史悠久。多倍體藥用植物具有耐儲藏運(yùn)輸、抗逆性強(qiáng)、藥用成分增加、產(chǎn)量增高等優(yōu)點(diǎn)［13-15］，黑果枸杞、錦雞兒、北蒼術(shù)、萱草、丹參等藥用植物的多倍體研究已取得較大進(jìn)展［16-20］。對于黃蜀葵的研究多集中在栽培技術(shù)以及成分分析方面［21-27］，對其多倍體研究較少。本試驗(yàn)采用秋水仙素處理法處理黃蜀葵幼苗，獲得多倍體黃蜀葵植株，通過形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定，為多倍體黃蜀葵的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃蜀葵種子來自山西海雪農(nóng)業(yè)科技有限公司。試驗(yàn)于2021 年3—10 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院進(jìn)行，挑選黃蜀葵種子種植于營養(yǎng)缽中，對其進(jìn)行秋水仙素處理。

多倍體誘導(dǎo)和鑒定的試劑為秋水仙素（0.1%、0.2%）、1%瓊脂溶膠、1%碘-碘化鉀溶液等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)方法 采用改良初生分生組織處理法進(jìn)行誘變，選取顆粒飽滿的黃蜀葵種子置于燒杯中浸泡24 h，在營養(yǎng)缽中進(jìn)行播種，選取長勢相同的植株進(jìn)行處理。共有6 個試驗(yàn)組和1 個對照組，每個試驗(yàn)組處理54 棵幼苗，秋水仙素設(shè)置0.1%、0.2%兩個濃度梯度，每個濃度下設(shè)置3 個處理時間，分別為24、48、72 h。待種子發(fā)芽生長至兩片子葉展開時，將配制好的秋水仙素瓊脂凝膠水溶液加熱并充分?jǐn)嚢柚?0 ℃呈半固體狀態(tài)，涂抹到剛萌發(fā)的頂芽上，充分包裹嫩芽，黑暗處理7 d，黑暗處理期間不澆水。不同濃度秋水仙素處理和時間組合如表1 所示。

表1 秋水仙素誘導(dǎo)濃度與時間

1.2.2 黃蜀葵變異株的形態(tài)觀察 ①成活率與變異率統(tǒng)計(jì)。暗處理的植株沒有出現(xiàn)萎蔫等病理狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)為成活株數(shù)。計(jì)算公式為，成活率=（成活株數(shù)/總株數(shù)）×100%。植株正常生長后，處理組與對照組相比，出現(xiàn)明顯的植株矮小、莖部膨大、葉片畸形等多倍體植株常見的形態(tài)學(xué)性狀，統(tǒng)計(jì)為變異植株。計(jì)算公式為，變異率=（變異株數(shù)/成活株數(shù)）×100%。②形態(tài)學(xué)觀察。在暗處理結(jié)束后，待植株生長歸于正常，統(tǒng)計(jì)成活幼苗和死亡幼苗的數(shù)量并記錄；35 d 后，記錄誘變成功的植株數(shù)；隨機(jī)選取試驗(yàn)組和對照組中的試驗(yàn)材料各5 株，測量其株高，對植株第3 片真葉的長、寬進(jìn)行測量并記錄，并計(jì)算葉形指數(shù)（葉長/葉寬）；③細(xì)胞學(xué)觀察。表皮氣孔的觀察，分別取試驗(yàn)組和對照組植株的第3 片真葉，用鑷子撕下下表皮，將其放在載玻片上加一滴1%碘-碘化鉀染液，靜置15 min，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個保衛(wèi)細(xì)胞，測量保衛(wèi)細(xì)胞以及氣孔的長度和寬度，觀察固定視野內(nèi)氣孔的數(shù)量并確定氣孔密度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel與SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對黃蜀葵幼苗成活率和形態(tài)變異率的影響

由表2 可知，當(dāng)處理濃度為0.1% 時，A1 組合成活率最高，為85.19%，變異率最低，為47.83%；A3 組合成活率最低，為51.85%，變異率最高，為64.29%。當(dāng)處理濃度為0.2% 時，B1 組合成活率最高，為55.56%，變異率最低，為70.00%；B3 組合成活率最低，為27.78%，變異率最高，為100.00%。同一時間處理下，B 處理成活率均小于A 處理，而變異率均大于A 處理。所有處理成活率大小為CK＞A1＞A2＞B1＞A3＞B2＞B3，變異率大小為 B3＞B2＞B1＞A3＞A2＞A1＞CK，同一處理?xiàng)l件下，成活率與變異率呈反比關(guān)系。

表2 不同處理對黃蜀葵幼苗的成活率和變異率的影響

2.2 不同處理對黃蜀葵幼苗形態(tài)指標(biāo)的影響

黃蜀葵幼苗經(jīng)過不同濃度不同時長的秋水仙素處理后，植株形態(tài)會出現(xiàn)明顯差異。與CK 植株相比，變異株明顯矮?。▓D1A）；其根系明顯變長（圖1B）；其葉片出現(xiàn)皺縮、畸形、增厚、顏色加深等情況（圖1C、圖1D），表明秋水仙素處理會使植株生長受阻，可促進(jìn)植株根系增長，而且會對植株葉片形態(tài)造成影響。

圖1 黃蜀葵CK 與變異株的形態(tài)特征比較

誘變后35 d，從CK 和變異株中隨機(jī)各選取5 株作為樣本，對其部分形態(tài)特征進(jìn)行測量，結(jié)果見表3。由表3 可知，變異株的平均葉長為1.82 cm，為CK的46.7%；葉寬為2.20 cm，為CK 的53.7%；葉形指數(shù)為CK 的87.4%；株高為7.31 cm，為CK 的38.7%。經(jīng)過誘變的植株葉長、葉寬、葉型指數(shù)以及株高均明顯低于CK，植株生長緩慢。表明秋水仙素處理對植株作用明顯，變異株具備多倍體植株的特征。

表3 黃蜀葵CK 與變異株的形態(tài)學(xué)指數(shù)差異

2.3 細(xì)胞學(xué)觀察

由圖2 可見，多倍體植株與正常植株不僅在形態(tài)學(xué)上具有差異，細(xì)胞學(xué)上也明顯差異。正常株葉片顏色較淺，葉片下表皮氣孔多而密，細(xì)胞之間有明確的界限；變異株葉片濃綠，氣孔之間沒有明確的細(xì)胞界限，數(shù)量少且排列松散。

圖2 黃蜀葵CK 和變異株的氣孔特征比較

統(tǒng)計(jì)固定視野下黃蜀葵CK 和變異株內(nèi)氣孔的個數(shù)、長度和寬度，結(jié)果見表4。由表4 可知，變異株的氣孔長度和寬度均顯著大于CK（P＜0.05），變異株的氣孔長度為 22.81 μm，為 CK 的 1.77 倍；氣孔寬度為 9.25 μm，是CK 的1.63 倍；變異株的氣孔開合度比CK 的更大，葉片保衛(wèi)細(xì)胞長度和寬度也均顯著大于CK（P＜0.05），分別為 CK 的 1.37 倍和 1.21 倍；而氣孔頻度顯著低于 CK（P＜0.05），為 CK 的 58.8%。變異株具有多倍體的部分特征。

表4 秋水仙素誘導(dǎo)黃蜀葵多倍體株系氣孔形態(tài)指標(biāo)比較

3 小結(jié)與討論

藥用植物多倍體根莖葉會變得巨大化、藥用活性成分會變高、抗逆性和抗病性增強(qiáng)［28］，有利于培育新品種，提高產(chǎn)量［29］。秋水仙素處理也會導(dǎo)致植株孕性降低、生長緩慢、畸形等。因此，要獲得優(yōu)良的多倍體新品種，必須經(jīng)過多代的選育和鑒定，方可用于生產(chǎn)［30］。

涂抹法和浸漬法是秋水仙素處理的常用方法［31］。李映樂等［32］用不同濃度的秋水仙素對人參果圓果組培苗進(jìn)行不同時間的處理；孫長君等［33］用秋水仙素對毛酸漿露白種子進(jìn)行不同時間的浸漬處理；吳青青等［34］用不同濃度的秋水仙素對百合黃精靈的組培苗鱗片進(jìn)行不同時間的處理，發(fā)現(xiàn)秋水仙素的濃度和處理時間對植株的成活率和變異率有較大影響，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。一些外界條件也會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，試驗(yàn)場所的溫度、水分、營養(yǎng)條件等均要適宜材料的生長，在操作過程中也要盡量避免人為因素對材料造成傷害。

多倍體主要是通過自然誘導(dǎo)和人工誘導(dǎo)產(chǎn)生，與二倍體植株相比，多倍體一般會表現(xiàn)出不同的性狀。吳婷等［35］采用浸泡法用秋水仙素對象鼻蘭種子進(jìn)行處理，四倍體植株表現(xiàn)出植株粗壯、根系發(fā)達(dá)等特征；張丞慧等［36］采用浸漬法用秋水仙素對新疆野蘋果進(jìn)行處理，得到的四倍體植株表現(xiàn)出葉片加厚、葉綠素含量增加、抗逆性提高等特征；李德利等［37］用浸泡法用秋水仙素對甜蕎種子進(jìn)行處理，多倍體甜蕎植株表現(xiàn)出株高降低、根系粗壯、葉片表面皺縮粗糙、花器官變大等特征；楊祥波等［38］研究發(fā)現(xiàn)，四倍體水稻會出現(xiàn)分蘗變多、谷粒變長等性狀。喬永剛等［39］以黃芩為試驗(yàn)材料，用秋水仙素處理后的植株表現(xiàn)出生長速度減緩、葉形指數(shù)變小等現(xiàn)象，并且黃芩變異株的氣孔增大、數(shù)量較少。吳婷等［40］用秋水仙素處理蝴蝶蘭后變異株形態(tài)和氣孔特征均發(fā)生了明顯變化。

秋水仙素有較強(qiáng)的毒性，對植株處理時間越長，死亡率就會越高，但變異率也會提高，合適的處理時間以及濃度對植物的多倍體育種至關(guān)重要。本試驗(yàn)采用0.1%、0.2%兩個濃度的秋水仙素對黃蜀葵幼苗生長點(diǎn)進(jìn)行涂抹，分別處理24、48、72 h，。結(jié)果表明，0.2% 濃度的秋水仙素處理48 h，成活率為48.15%，變異率92.31%，為較佳處理組合。用秋水仙素處理黃蜀葵幼苗后，變異株出現(xiàn)植株矮小、生長受阻、根系增長、葉片皺縮、畸形、增厚、顏色加深等現(xiàn)象，并且氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞增大，密度減小，變異株表現(xiàn)出多倍體的部分性狀。該結(jié)果可為黃蜀葵多倍體育種工作提供一定的參考。