劉耀川，龔商羽，關(guān) 淼，楊洺揚(yáng)，申貫?zāi)?，?旭，郭首龍

（1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110164；2.錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

大腸埃希菌是自然界廣泛存在的一種共棲型微生物，通常為條件性致病菌，以其他疾病的并發(fā)致病菌或繼發(fā)致病菌的形勢(shì)存在［1］。該菌血清型眾多，其中部分特殊血清型的大腸埃希菌能引起人和動(dòng)物感染，而 O1、O2、O18 及 O78 則是引起禽大腸桿菌病的主要病原。該病是禽類養(yǎng)殖過程中的常發(fā)疾病，具有較高的發(fā)病率及死亡率，給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。獸醫(yī)臨床仍然選擇抗生素作為禽大腸桿菌病的主要治療手段，隨著抗生素的使用，大腸埃希菌在藥物選擇壓力的作用下逐漸產(chǎn)生耐藥性，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅，急需尋找有效的抗生素替代治療方案。

苜蓿（Medicago sativa）是種植面積廣泛的優(yōu)良牧草，具有較好的環(huán)境適應(yīng)能力及較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)作為古籍記載的中藥，苜蓿具有較好的清熱、通淋、利血等功效，對(duì)黃疸、尿路結(jié)石、細(xì)菌性腹瀉等疾病有一定療效。本試驗(yàn)對(duì)苜蓿提取液體外抑菌活性進(jìn)行研究，旨在為苜蓿精加工及減抗治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Eppendorf 5810R 冷凍低溫離心機(jī)，北京鵬昆科貿(mào)生產(chǎn)；艾龍?zhí)豎G-H 生物安全柜，山東濰坊醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；DZ-380L-X 高壓立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療生產(chǎn)；Herocell 180DX 隔水式恒溫電熱培養(yǎng)箱，上海潤(rùn)度生物科技有限公司生產(chǎn)；精科752N 紫外/可見光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)；KQ-450DX 數(shù)控超聲波清洗器，舟山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；SHV-IB 型雙A 循環(huán)水多用真空泵，鄭州長(zhǎng)宏科貿(mào)有限公司生產(chǎn)；艾本德 10、200、1 000 μL 微量移液器，青島興達(dá)生物科技生產(chǎn)。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、麥康凱瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)買；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管于杭州濱和微生物試劑有限公司購(gòu)買；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)F20201108）于國(guó)藥集團(tuán)購(gòu)買；其他化學(xué)常用試劑如氫氧化鈉、乙醇（分析純）、氯化鋁、亞硝酸鈉等，由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.100 4 g，定容于50 mL 容量瓶中，充分搖勻后3 倍稀釋，所得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0.67 g/L［3］。

分別取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液 2、4、6、8、10、12 及14 mL 于50 mL 容量瓶中。按照5 mL 5% NaNO26 min、10 mL 1% Al（NO3）36 min、20 mL 4% NaOH 15 min 的順序進(jìn)行反應(yīng)后，定容、搖勻。以ddH2O 為對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。

1.3.2 苜蓿黃酮化合物提取及濃度測(cè)定 根據(jù)董曉寧等［5］報(bào)道的最佳提取方案，按照液料比1∶45、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、超聲提取時(shí)間50 min 的工藝對(duì)苜蓿進(jìn)行提取。具體方法為，精確稱量10 g 苜蓿粉末，在燒杯中加入55%的乙醇溶液，封口靜置于室溫環(huán)境浸泡5 h。將浸泡液于300 W 功率超聲處理50 min，減壓抽濾后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至濃縮液無明顯乙醇味后，將濃縮液于錐形瓶中用0.02 g 活性炭進(jìn)行脫色處理。定容50 mL 后，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理，在510 nm 處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定黃酮化合物含量。

1.3.3 培養(yǎng)基制備 將營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂按照說明書要求配置成相應(yīng)濃度培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后分裝于離心管及制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。并將裝有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的離心管、固體麥康凱培養(yǎng)基及固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜檢菌。將檢菌合格的培養(yǎng)基密封，保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.3.4 大腸埃希菌分離及鑒定 用無菌棉拭子取患病雞泄殖腔樣品，并將棉拭子置于盛有無菌生理鹽水的離心管中4 ℃密封保存并盡快送至實(shí)驗(yàn)室。在潔凈工作臺(tái)中取100 μL 生理鹽水樣品，用三角玻璃棒均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基中，并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。選取菌落大小、形狀不同的單菌落于無菌NB 中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并將培養(yǎng)液于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行初步鑒別培養(yǎng)，培養(yǎng)方法及條件與普通瓊脂培養(yǎng)基方式相同。選取麥康凱培養(yǎng)基中圓形且具有紅色金屬光澤的單獨(dú)菌落，對(duì)其進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。根據(jù)顏色反應(yīng)及編碼手冊(cè)對(duì)應(yīng)編碼，最終確定大腸埃希菌分離株。

1.3.5 體外抑菌活性研究 將大腸埃希菌分離株接種于無菌NB 肉湯中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中180 r/min 過夜培養(yǎng)。取 100 μL 渾濁 NB 培養(yǎng)液，均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 進(jìn)行菌株復(fù)壯。

取復(fù)壯后的單獨(dú)菌落于NB 肉湯中振蕩培養(yǎng)，用無菌NB 肉湯為對(duì)照測(cè)定培養(yǎng)物OD值，待菌液OD600nm為0.4～0.6，此時(shí)菌液濃度約為1×108CFU/mL，可用于藥物敏感性試驗(yàn)。參考美國(guó)CLSI 2019 年推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)定苜蓿提取液對(duì)大腸埃希菌分離株的最小抑菌濃度（MIC），以大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922 為質(zhì)控菌，設(shè)置氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿提取液黃酮化合物含量

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及用蘆丁比色法測(cè)定的苜蓿提取液吸光度，測(cè)得苜蓿提取液中黃酮類化合物含量為9.63 mg/mL。

2.2 大腸埃希菌分離鑒定結(jié)果

在63 個(gè)臨床病例的泄殖腔棉拭子中，經(jīng)麥康凱瓊脂鑒別培養(yǎng)基初步分離到大腸埃希菌52 株。52株大腸埃希菌疑似分離株經(jīng)腸桿菌科生化反應(yīng)鑒定培養(yǎng)、編碼比對(duì)，最終確定大腸埃希菌分離株42 株，大腸埃希菌分離率為66.7%。

2.3 苜蓿提取液體外抑菌活性

采用微量肉湯稀釋法分別測(cè)定氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品和苜蓿提取液對(duì)42 株大腸埃希菌分離株的MIC，以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922 作為質(zhì)控菌。結(jié)果表明，氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)質(zhì)控菌的MIC 為0.25 mg/L，符合CLSI評(píng)估范圍，證明該數(shù)據(jù)及試驗(yàn)操作可信。

氨芐西林標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)42 株大腸埃希菌分離株的MIC50和 MIC90分別為 0.5、8.0 mg/L，其整體 MIC 為0.125～64.000 mg/L，部分分離株對(duì)氨芐西林已產(chǎn)生耐藥性。

本研究苜蓿提取物按其黃酮化合物含量計(jì)算，原液初始濃度為9 630 mg/L。按倍比稀釋計(jì)算，抑菌活性研究中工作液濃度為9.404～9 630.000 mg/L。其對(duì)大腸埃希菌分離株MIC50和MIC90分別為1 203.75、4 815.00 mg/L，其MIC為601.87～9 630.00 mg/L（表1）。

表1 大腸埃希菌分離株體外抑菌活性研究結(jié)果

3 討論

禽大腸桿菌病是由大腸埃希菌引起的一類原發(fā)或繼發(fā)性禽類傳染病，其主要癥狀為心包炎、滑膜炎、大腸桿菌性肉芽腫、臍炎、蜂窩組織炎等，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖威脅巨大。隨著大腸埃希菌耐藥菌株的出現(xiàn)，該病的治療也愈發(fā)困難。苜蓿是一種在中國(guó)分布較廣的多年生草本植物，在中國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)已作為優(yōu)良牧草長(zhǎng)期使用。近代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其含有的活性物質(zhì)對(duì)常見病原菌及耐藥性病原菌具有一定的抑制功能。楊蕾等［6］報(bào)道苜蓿黃酮提取物對(duì)云南地區(qū)分離的枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的MIC 分別為1.5、1.5、3.0、2.0 和 2.5 mg/mL；廖天錄等［7］報(bào)道航天苜蓿中黃酮提取物對(duì)甘肅地區(qū)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的 MIC 為 0.4 和 0.7 mg/mL；李波等［8］報(bào)道苜蓿皂苷提取物對(duì)齊齊哈爾地區(qū)大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌的 MIC 分別為 0.024 0、0.047 9 mg/mL，對(duì)真菌無明顯抑制效果；盧小康等［9］報(bào)道苜蓿提取液對(duì)甘肅地區(qū)綠膿桿菌、停乳鏈球菌、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌的 MIC 分別為 0.674、1.347、2.695 及2.695 mg/mL；王家皓等［10］報(bào)道南苜蓿葉總黃酮提取物對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC 分別為0.15、0.20 mg/mL。

本試驗(yàn)苜蓿黃酮提取液對(duì)禽源大腸埃希菌分離株的 MIC50和 MIC90分別為 1 203.75 、4 815.00 mg/L，對(duì)苜蓿提取液體外抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，提取液對(duì)臨床分離的大腸埃希菌具有一定的抑制效果，部分分離株對(duì)提取液敏感性較高，在相對(duì)較低濃度時(shí)（601.87 mg/L）就出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制效果。而部分分離株則對(duì)提取液不敏感，在初始工作濃度時(shí)仍正常生長(zhǎng)，未見明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。對(duì)氨芐西林耐藥菌株MIC 分析，并未發(fā)現(xiàn)明顯的耐藥菌株抑制活性，即對(duì)部分氨芐西林耐藥菌株表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制效果，而對(duì)部分氨芐西林耐藥菌株未見生長(zhǎng)抑制。分析可能是黃酮類化合物抑菌機(jī)制與β-內(nèi)酰胺類抗生素抑菌機(jī)制不同。