蔡衛(wèi)忠，吳早林，全 濤，楊克禮，田永祥

（1.紅安縣農業(yè)農村局，湖北紅安 438499；2.鶴峰縣農業(yè)農村局，湖北鶴峰 445800；3.湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，武漢 430064）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是重要的人畜共患病原，鏈球菌感染可引起腦膜炎、心肌炎和敗血癥等癥狀。豬鏈球菌病是由鏈球菌引起的豬急性、敗血癥型和腦膜炎型的人畜共患傳染?。?］，該病在世界范圍內廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失，同時給相關從業(yè)人員的生命安全造成了嚴重的威脅［2］。豬鏈球菌據(jù)其莢膜多糖的差異，有35 個血清型，引起豬和人發(fā)病的以2 型豬鏈球菌為主［3，4］。臨床上有急性和慢性兩種病例。急性一般未出現(xiàn)癥狀即死亡，主要是敗血癥；慢性主要表現(xiàn)為關節(jié)腫大、跛行，耳后、腹下、肛門等有出血點等。急性型發(fā)病率和死亡率均較高；慢性型死亡率較低，但影響感染豬的生長發(fā)育［4］。

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）在分類學上屬圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovi?rus）［5］。2016 年以前，在全球范圍內僅發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）有PCV1 和PCV2 兩個基因型［6］。PCV1 對豬無致病性。PCV2 感染后主要危害是引起豬體的免疫抑制，導致繼發(fā)其他疫病從而造成死亡［7］。2016 年，美國報道發(fā)現(xiàn)一種新的圓環(huán)病毒-豬圓環(huán)病毒3 型（Porcine circovirus type 3，PCV3），隨后韓國、波蘭、意大利和中國等國均報道有PCV3 的 發(fā) 生［8，9］。PCV3 感 染 豬 的 臨 床 表 現(xiàn) 與PCV2 相似。臨床上，PCV3 可單獨存在，也可與其他病原混合感染［10］。

2021 年10 月份，湖北省紅安縣某規(guī)?；i場保育豬先后大量發(fā)病，出現(xiàn)持續(xù)性、反復性腹瀉、發(fā)燒、氣喘等癥狀，四肢前端、后背、臀部皮膚發(fā)紺，后背兩側皮膚有散在紅色點狀丘疹，持續(xù)近20 d，病豬消瘦，部分豬只死亡，經濟損失較大。將豬場送檢的病料送至相關實驗室進行病原分離鑒定和PCR 檢測，診斷為豬鏈球菌和PCV3 混合感染。根據(jù)臨床及實驗室診斷結果，制定了綜合防控技術方案，經實施后，疫情得到了有效控制。將該病的防控工作總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

發(fā)病瀕臨死亡保育豬2 頭，由湖北省紅安縣某規(guī)模化豬場送至相關實驗室進行檢測。

1.2 試劑

Viral DNA/RNA Miniprep Kit（Axygen Scientif?ic），Ex-Taq 酶、Prime Script One Step RT-PCR Kit、DL 2000 Marker（Takara），M-肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基以及其他生化培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司；其他生化試劑為國產分析純，購自商業(yè)公司。PCV3 檢測引物由北京擎科生物工程公司合成。

1.3 樣品處理

無菌采集病料組織直接涂布載玻片，進行革蘭氏染色；無菌采集病豬肺、脾及淋巴結等組織，制作抹片，經干燥、火焰固定后進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.4 細菌分離培養(yǎng)

于超凈工作臺中用接種環(huán)取前述病料直接接種于鮮血瓊脂平板，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48 h 后，挑取典型菌落接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)24~48 h，革蘭氏染色、鏡檢，并做進一步的生化試驗。

1.5 病毒核酸的提取

將病料組織與DMEM 溶液按體積比1∶5 混合，充分勻漿，反復凍融3~5 次，立即提取核酸或置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。病毒核酸按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說明書進行提取。

1.6 PCV3 PCR 擴增

取提取的DNA，利用文獻［11］中的引物對其進行PCR 擴增。PCR 反應體系總體積為50 μL，包含10 × PCR buffer 5.0 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，Ex-Taq（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 5.0 μL，ddH2O 補充至50 μL。循環(huán)參數(shù)為94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，拍照記錄結果。

1.7 防控措施

加強管理，全面消毒。嚴禁生產區(qū)工作人員出入，飼養(yǎng)員和各類用具嚴禁串舍。舍外場地和豬舍空欄用2%~3%的氫氧化鈉（燒堿）溶液噴灑消毒。豬舍內每3 d 用消毒水帶豬消毒1 次。

緊急接種。對無明顯癥狀的豬只，用自家苗緊急免疫，2~4 mL/頭。

對癥治療。對繼發(fā)感染的豬只，根據(jù)藥敏試驗結果，應用高敏抗菌藥物進行治療；對呼吸困難的豬只使用麻黃堿、氨茶堿等止咳平喘藥物進行治療；對發(fā)熱豬只使用安乃近、氨基比林等退燒藥物進行治療。

輔助治療。PCV3 為病毒性疫病，使用抗生素治療無效，建議配合使用干擾素、免疫球蛋白、病毒靈、高免血清等廣譜抗病毒的藥物進行輔助治療。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)和鑒定結果

病料組織接種鮮血瓊脂平板，經37 ℃培養(yǎng)24 h后，可見灰白色、稍微隆起的、表面光滑濕潤的半透明的小菌落，菌落周圍可見約1 mm 透明溶血環(huán)，呈典型的β-型溶血（圖1）。革蘭氏染色，鏡檢可見大量短鏈狀或長鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌（圖2）。對分離純化的細菌進行生化試驗，結果該菌發(fā)酵麥芽糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、水楊酸和山梨醇，不發(fā)酵阿拉伯糖和木糖，綜上判定該菌為鏈球菌。

圖1 鮮血瓊脂平板上的菌落

圖2 顯微鏡下的革蘭氏陽性鏈球菌

2.2 PCV3 PCR 檢測結果

以病豬組織中提取的病毒DNA 為模板，利用文獻中［11］PCV3 特異性引物進行PCR 擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果所檢測的組織樣品全部擴增出與預期產物大小相一致的目的條帶（約1 021 bp），即為PCV3 陽性（圖3）。

圖3 PCV3 PCR 擴增產物電泳

綜合檢測結果可知，所檢8 份組織樣品均為豬圓環(huán)病毒3 型陽性，結合臨床表現(xiàn)及細菌分離培養(yǎng)結果，判定該豬場本次暴發(fā)的疫情為豬鏈球菌和豬圓環(huán)病毒3 型的混合感染。

按“1.7”綜合防控措施實施14 d 后，該豬場的發(fā)病豬頭數(shù)日益減少，豬場已無死亡病例發(fā)生，疫病得到控制。30 d 后疫情平息，生產恢復正常。

3 討論

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病理變化及細菌分離培養(yǎng)結果，結合實驗室分子生物學檢測結果，8 份組織樣品PCV3 均為陽性，確診該豬場發(fā)生的疫病為豬鏈球菌與PCV3 的混合感染。豬鏈球菌病一年四季均有發(fā)生，飼料營養(yǎng)失衡、飼養(yǎng)環(huán)境差、應激等因素均可誘發(fā)該病［12］。但在很多情況下，鏈球菌可繼發(fā)于其他病原感染之后，如PRRSV 感染、PCV2 感染等。

自2017 年以來，中國包括湖北省、山東省及廣東 省 等10 多 個 省 份 均 發(fā) 現(xiàn) 有PCV3 的 存 在［13，14］。PCV3 初次發(fā)現(xiàn)時，感染PCV3 的豬并無特征性臨床特征呈現(xiàn)，僅是組織切片中部分組織出現(xiàn)了病理變化［8］。但這些病理變化不一定是豬感染PCV3 后引起的特征性病變。目前由于PCV3 無有效藥物進行治療，同時PCV3 分離培養(yǎng)難度相對較大，再加上PCV3 的病原學特性、流行病學特點、致病機理等尚不完全清楚，因此PCV3 的預防和控制更加不易。

混合感染常常使豬病情復雜化，給疾病的診斷、治療增加了難度，因此對發(fā)病豬盡早確診、盡早治療，以減少混合感染、繼發(fā)感染病例的發(fā)生。各類養(yǎng)豬場，對于疫病的防控均應貫徹預防為主的方針，加強飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生。豬舍保持良好的通風和適宜的溫濕度；給予豬只充足的營養(yǎng)，減少應激；定期消毒，交替使用消毒藥，防止耐藥菌株的產生。只有采取上述綜合防控措施才能最大限度地減少疫病的發(fā)生，確保養(yǎng)殖場健康可持續(xù)發(fā)展。