王 越

（沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧撫順 113112）

間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多潛能種子細(xì)胞［1］。相關(guān)研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞具有較好的增殖能力，具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的能力，因其在組織工程和細(xì)胞替代治療的臨床研究而備受關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞類(lèi)型較多，常見(jiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于骨髓［2］，但骨髓細(xì)胞含量相對(duì)較低，分離、純化、培養(yǎng)過(guò)程中均存在一定的困難，且隨著人體年齡的增長(zhǎng)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞含量和增殖能力會(huì)下降。新生兒出生后廢棄的臍帶組織中含有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs），具有強(qiáng)大的自我更新能力和向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞及肌細(xì)胞分化的潛能。因其來(lái)源豐富，易于獲取，且獲取無(wú)創(chuàng)傷加之免疫原性低下，增殖能力強(qiáng)，無(wú)倫理性爭(zhēng)議等優(yōu)勢(shì)，成為組織修復(fù)和器官重建理想的種子細(xì)胞來(lái)源，廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中［3］。

近年來(lái)分離、培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取得階段性進(jìn)展，且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究相對(duì)較多［4］，如何采取積極有效的措施獲得快速、高效的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有重要的意義。目前，對(duì)于臍帶干細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有組織貼塊法和胰酶消化法，體外培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)選擇何種培養(yǎng)體系存在一定的爭(zhēng)議。

本研究比較了不同品牌培養(yǎng)基對(duì)原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果的影響，以期優(yōu)化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

健康足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶2 份，20～30 cm/份，由某三甲醫(yī)院提供。

1.2 試劑

生理鹽水，阿拉丁試劑（上海）有限公司；無(wú)血清培養(yǎng)基1（Takara）、無(wú)血清培養(yǎng)基2（Lonza）、無(wú)血清培養(yǎng)基3（國(guó)產(chǎn)）、胰蛋白酶、臺(tái)盼藍(lán)、細(xì)胞凍存液（默塞爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司）。

1.3 儀器

離心機(jī)、熒光倒置顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、生化培養(yǎng)箱、水浴鍋等。

1.4 方法

1.4.1 臍帶獲取 選取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶2 根，由某三甲醫(yī)院提供，將其放置在臍帶保存液中，保存時(shí)間不超過(guò)8 h，冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

1.4.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取足月剖宮產(chǎn)臍帶20～30 cm，無(wú)菌條件下放入盛有生理鹽水的廣口瓶中，4 ℃冰箱保存。超凈臺(tái)紫外線照射30 min 后，取出臍帶，使用75%乙醇浸泡，并用生理鹽水反復(fù)沖洗后去除臍帶外膜及臍動(dòng)靜脈，用眼科剪將臍帶剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm 的小塊。隨后剝?nèi)∪A通氏膠均勻接種至100 mm 培養(yǎng)皿中，加入6 mL 培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。其中，Takara、Lonza、國(guó)產(chǎn)3 種培養(yǎng)基培養(yǎng)原代UCMSCs 的培養(yǎng)皿數(shù)量、組織接種數(shù)量、重量均一致。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，3 d 進(jìn)行半量換液，5 d后進(jìn)行全量換液，之后每隔3 d 進(jìn)行全量換液。當(dāng)觀察到細(xì)胞融合生長(zhǎng)80%以上，進(jìn)行傳代操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的影響

臍帶經(jīng)組織切塊處理后，用3 種不同品牌的完全培養(yǎng)基（Takara、Lonza、國(guó)產(chǎn)）進(jìn)行培養(yǎng)。使用Ta?kara 和Lonza 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的1 號(hào)樣本組織塊在第8 天能觀察到有細(xì)胞爬出，散落分布在組織塊周?chē)蛐纬尚》秶寺?，如圖1T、圖1L 所示。2 d 后70%～80%細(xì)胞融合，細(xì)胞呈平行或旋渦排列。

圖1 1 號(hào)樣本人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

使用國(guó)產(chǎn)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的1 號(hào)樣本組織塊在第10 天后觀察到有極少量間充質(zhì)干細(xì)胞爬出，排列不規(guī)則且伴有其他雜細(xì)胞，且在換液2 d 后細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，顯微鏡下未觀察到明顯增長(zhǎng)。

使用Takara 和Lonza 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的2 號(hào)樣本組織塊在第9 天能觀察到有間充質(zhì)干細(xì)胞爬出，形態(tài)與1 號(hào)樣本中使用Takara、Lonza 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相似。使用國(guó)產(chǎn)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的2 號(hào)樣本組織塊在2 周內(nèi)未觀察到有間充質(zhì)干細(xì)胞爬出，于第15 天棄掉（圖2）。

圖2 2 號(hào)樣本人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量、活率的影響

1 號(hào)樣本在使用Takara 培養(yǎng)基第15 天后傳至P2 代，細(xì)胞總數(shù)為5.8×107個(gè)，細(xì)胞活率為98%，在凍存21 d 后進(jìn)行復(fù)蘇，單支凍存管復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)為6.57×106個(gè)，細(xì)胞活率為90%；在使用Lonza 培養(yǎng)基后第17 天后傳至P2 代，細(xì)胞總數(shù)為4.5×107個(gè)，細(xì)胞活率為93%，在凍存21 d 后進(jìn)行復(fù)蘇，單支凍存管復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)為6.27×106個(gè)，細(xì)胞活率為99%。

2 號(hào)樣本在使用Takara 培養(yǎng)基后第13 天后傳至P2 代，細(xì)胞總數(shù)為2.5×107個(gè)，細(xì)胞活率為98%，在凍存21 d 后進(jìn)行復(fù)蘇，單支凍存管復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)為1.08×107個(gè)，細(xì)胞活率為89%；在使用Lonza 培養(yǎng)基第14 天后傳至P2 代，細(xì)胞總數(shù)為2.0×107個(gè)，細(xì)胞活率為95%，在凍存21 d 后進(jìn)行復(fù)蘇，單支凍存管復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)為6.36×106個(gè)，細(xì)胞活率為95%。結(jié)合2 個(gè)樣本的細(xì)胞總數(shù)、復(fù)蘇后的細(xì)胞得率進(jìn)行分析，使用Takara 培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSCs 在細(xì)胞爬出時(shí)間以及細(xì)胞數(shù)的數(shù)據(jù)上優(yōu)于使用Lonza 培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSCs（圖3），使用Lonza 培養(yǎng)基，雖細(xì)胞爬出時(shí)間以及細(xì)胞數(shù)不及Takara，但凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞活率高于Takara（圖4）。

圖3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)至P2 代的UC-MSCs 細(xì)胞總數(shù)（a）及復(fù)蘇凍存的P2 代的UC-MSCs 細(xì)胞總數(shù)（b）

圖4 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)至P2 代的UC-MSCs 細(xì)胞活率（a）及樣本復(fù)蘇凍存的P2 代的UC-MSCs 細(xì)胞凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活率（b）

3 討論

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在不同的增殖分化階段，對(duì)營(yíng)養(yǎng)液的需求有所差異，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類(lèi)和濃度的差異均會(huì)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)產(chǎn)生一定的影響［5-7］。因此選擇合適的培養(yǎng)基是獲得較為優(yōu)質(zhì)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的前提條件。本研究在處理樣本的過(guò)程中使用不同品牌的培養(yǎng)基對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，對(duì)比UC-MSCs 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞總數(shù)、復(fù)蘇后的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率等指標(biāo)，使用Takara 培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSCs，在細(xì)胞爬出時(shí)間及細(xì)胞數(shù)上優(yōu)于Lonza 培養(yǎng)基，使用Lonza 培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSCs，在凍存復(fù)蘇的細(xì)胞活率上優(yōu)于Takara 培養(yǎng)基。使用某國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)UC-MSCs，增殖停止。