蔡冬冬，李建崗，范 毅，羅 毅，崔鵬博，胡曉亮，田志革*

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省成都市動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點實驗室，四川 宜賓 644000；4.成都海關(guān)，四川 成都 610041）

1 材料與方法

1.1 病料來源 一只35日齡博美犬患有嚴(yán)重的腸炎，臨床癥狀表現(xiàn)為食欲減退，嘔吐，發(fā)熱，腹瀉，利用膠體金試紙條檢測糞便，結(jié)果為犬冠狀病毒陽性，犬瘟熱病毒陰性，犬細(xì)小病毒陰性和犬腺病毒陰性。

按照DNA/RNA 提取試劑盒說明書，提取病犬糞便的DNA/RNA，進(jìn)一步加入M-MLV將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，備用。

1.2 主要試劑 病毒總RNA/DNA 提取試劑盒，膠回收試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Ex Taq 酶、MLV、RRI。

1.3 引物設(shè)計 利用犬冠狀病毒鑒定引物R-F：5′-CCTTAAGAACTAAACTTATGA-3′；R-R：5′-ATGCCGACACAAGTCTTAAAG-3′對糞便進(jìn)行PCR鑒定，根據(jù)測序結(jié)果以HLJ-071 和CB/05 基因序列（登錄號為KY063616.1 和KP981644.1）設(shè)計測序引物（表1）。

表1 引物信息

1.4 PCR 擴(kuò)增及測序 PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在10 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳，切膠并回收目的片段，由長春庫美生物科技有限公司測序。將序列拼接后提交NCBI，命名為BM35，登錄號為MT919267。

1.5 基因序列的比較分析和重組分析 利用DNAStar 軟件對BM35 的3′端基因組序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA6.0 構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹分析BM35 的3′端序列，分析比較BM35 與參考毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，序列信息見表2。利用Simplot 軟件進(jìn)行BM35 的重組分析。

表2 CCoV毒株信息

2 結(jié)果

2.1 犬冠狀病毒的鑒定 犬冠狀病毒特異性引物PCR 擴(kuò)增的片段大小為409 bp，與預(yù)期片段大小一致（見圖1），測序結(jié)果經(jīng)比對確定為犬冠狀病毒，將該毒株命名為BM35。對5對測序引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增、測序，拼接得到BM35 的3′端序列，片段長度為8 870 bp。

圖1 犬冠狀病毒的鑒定

2.2 基因序列的比較分析 BM35與參考序列之間的同源性最高的為B639/ZJ/2019（95.9%），與國內(nèi)分離株HLJ-071 的同源性為91.5%，與經(jīng)典CCoV IIa 分離株1-71 和K378 的同源性分別為90.8%和91.1%，與日本分離株FC1 的同源性為92.4%。

2.3 BM35 的遺傳進(jìn)化分析 使用MEGA6.0 軟件將BM35 與國內(nèi)外犬冠狀病毒核酸序列進(jìn)行比對，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示：基于3′端序列比對，BM35與浙江株B639/ZJ/2019、臺灣株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47 處于同一分支，該分支獨立成為一簇，區(qū)別于CCoV I型和II 型分支（見圖2A）；基于S 基因建立的進(jìn)化樹顯示BM35 與浙江株B639/ZJ/2019、臺灣株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47 處于同一獨立分支（見圖2B）。

圖2 3′端和S基因的遺傳進(jìn)化樹

2.4 BM35的重組分析 由于BM35與臺灣株和國外株的遺傳關(guān)系密切，因此推測BM35 可能會發(fā)生重組。重組分析結(jié)果顯示：BM35在S基因大約1 000 bp 處與臺灣株NTU156 和越南株HCM47發(fā)生了重組。

3 討論

3.1 CCoV 的流行病學(xué) CCoV 是引起犬急性胃腸炎的重要病原，1971 年由德國首次報道后，相繼在亞洲、南美洲、北美洲等多個國家和地區(qū)流行，給經(jīng)濟(jì)動物產(chǎn)業(yè)帶來極大的危害。2005年以來，我國學(xué)者在黑龍江、江蘇、遼寧、云南和吉林省進(jìn)行了CCoV 流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血清陽性率為28.36%～87.2%，說明CCoV 在我國呈廣泛性分布［1-2］。由于CCoV本身容易與自身及其他冠狀病毒發(fā)生基因重組，而犬作為人類最主要的伴侶動物，與人有著最密切的接觸，使得人們開始重新評估CCoV 對人類的潛在危害性，具有一定的公共衛(wèi)生意義。

本研究從患病犬中鑒定出一株CCoV（BM35），遺傳進(jìn)化樹分析顯示其3′端和S基因序列與浙江株B639/ZJ/2019、臺灣株NTU336、日本株FC1 和越南株HCM47的遺傳關(guān)系較近，處于同一獨立分支，而與CCoV IIa 型毒株1-71 和K378，CCoV IIb型毒株450/07，國內(nèi)分離株HLJ-071 等毒株的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.2 CCoV 的同源重組與進(jìn)化 同源重組和點突變是冠狀病毒遺傳進(jìn)化的主要動力之一［3-4］。盡管多數(shù)犬感染CCoV 后呈現(xiàn)腸道的病理變化，但近年來國外研究報道顯示CCoV能夠由僅引起腸道變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿斫M織產(chǎn)生明顯病變，甚至導(dǎo)致犬死亡。BGF株能夠產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，基因組序列分析發(fā)現(xiàn)在M 蛋白的末端具有高度可變區(qū)［5］。2009 年，在引起犬急性腸炎的流行病學(xué)監(jiān)測中分離到4株CCoV II型毒株，致病性分析發(fā)現(xiàn)其能夠?qū)е氯劳?，這4 株病毒的典型特征是在S 基因的N 端存在TGEV 重組的跡象［6］。2019年，陳思等［7］分離到一株CCoV HLJ-073，其S、E和M 基因與FCoV WSU79-1683 和CCoV 的A76發(fā)生過重組，并且HLJ-073 有ORF3abc 缺失，導(dǎo)致其能夠在犬單核巨噬細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞THP-1 中復(fù)制。2021 年，田志革等［8］分離到的一株CCoV HLJ-071，能夠在犬單核巨噬細(xì)胞中復(fù)制，說明CCoV在國內(nèi)經(jīng)歷了快速進(jìn)化。

4 結(jié)論

本研究鑒定了一株CCoV（BM35），遺傳分析發(fā)現(xiàn)其與多株國外毒株的遺傳關(guān)系較近，并且與臺灣株NTU156和越南株HCM47發(fā)生過重組，這有助于了解國內(nèi)CCoV 的流行病學(xué)特征，為后續(xù)診斷試劑和疫苗的開發(fā)提供依據(jù)。