蔡 英，釧定澤，陳慶華，劉繼濤

(1.云南白藥集團健康產品有限公司，昆明 650217；2.昆明理工大學材料科學與工程學院，昆明 650093)

0 引 言

成熟的人牙釉質(human enamel, HE)是一種高度礦化的組織，由95%～97%的無機礦物質組成[1]。無機礦物質主要由羥基磷灰石(HA)晶體組成[2]，這種HA晶體呈六角晶柱狀，平行排列且垂直于牙釉質表面，形成納米級HA棱柱結構[3]。正常情況下，HE是一種相對穩(wěn)定的結構，脫礦和再礦化處于動態(tài)平衡狀態(tài)。然而，當這種平衡被破壞后，會使牙釉質脫礦[4]并可能生成早期齲齒。

臨床上針對早期釉質齲，主要采用氟化物進行再礦化治療。但氟化物過量會導致氟斑牙、氟骨癥、急性氟中毒等毒副作用[5-6]。仿生牙釉質再礦化是一種新的、現(xiàn)代的早期齲齒治療方法[7]。釉原蛋白、PAMAM樹枝狀大分子、殼聚糖[8-9]、Tuftelin衍生肽[10]、自組裝肽P11-4[11]等新型材料，都能誘導牙釉質仿生再礦化，在牙釉質表面生成HA晶體。但這些材料存在很多復雜多變的問題，不利于后續(xù)臨床應用工作的開展。HA具有與牙齒硬組織相似的礦物質含量，具有較高的生物活性和生物相容性[12]。單獨應用HA材料進行牙釉質再礦化，主要利用其納米尺寸效應填充脫礦部位，因此對牙釉質齲損的再礦化作用有限。

在成釉細胞介導的牙釉質無機-有機生物礦化過程中，多種蛋白質成分起到了關鍵作用。同時，成熟牙釉質中的少量蛋白質殘留物，賦予其驚人的結構力學性能[13]。這些蛋白質殘留物的氨基酸(AA)組成主要以甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等含量最高[14]，Linden等[15]發(fā)現(xiàn)，牛牙釉質表層下蛋白質在脫礦過程中丟失的氨基酸主要為Gly、Glu、Asp等，丟失的這類AA可能在礦化過程中參與了HA晶體的定向生長過程[16]。Li等[17-18]研究證明，Glu和Asp能夠吸附在酸蝕釉質晶體表面，定向排列束狀類釉質晶體層。劉繼濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Glu、絲氨酸(Ser)和Asp復合改性HA材料對酸蝕牛牙釉質體外再礦化的修復效果較好。

氧化石墨烯(GO)具有比表面積大、分散性好、可生物降解、層間嵌有豐富含氧基團(如羥基、羧基和環(huán)氧基團)的特性，這些含氧官能團使GO很好地分散在水溶液中，可與金屬離子或納米粒子結合[20-22]。劉繼濤等[23]研究發(fā)現(xiàn)，GO改性HA復合材料具有良好的生物相容性，應用于酸蝕牛牙釉質體外再礦化，可使深層脫礦的釉質得到良好修復，并促進了脫礦釉柱間隙中有序排列晶體的生成。

本文在課題組前期研究的基礎上，采用化學均相沉淀法，制備了Gly/GO/HA、Asp/GO/HA復合材料和不含改性成分的HA。對復合材料的細胞毒性進行測試，考察其對酸蝕人牙釉質體外再礦化的影響，并討論不同復合材料的再礦化機制。

1 實 驗

1.1 實驗材料

氨水，分析純，廣東光華科技股份有限公司；NaN3，分析純，福晨(天津)化學試劑有限公司；去離子水，自制；其他試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 復合材料的制備

本文設計了3組實驗材料，1組為不含AA和GO的HA對照組，2組為含30 mmol/L的Gly和0.05%(質量分數(shù))GO的Gly/GO/HA，3組為含30 mmol/L的Asp和0.05%GO的Asp/GO/HA。將Ca(NO3)2·4H2O(14.169 g，60 mmol)和對應濃度的AA/GO溶解于1 600 mL去離子水中，超聲分散至無可見GO顆粒，得到淺黃色透明溶液。將混合物加熱，并在實驗過程中保持(37±1)℃。將(NH4)2HPO4(4.752 g，35.98 mmol)溶于800 mL去離子水中，在約120 min內緩慢地滴定到前述混合物中。用2.5%的NH3·H2O調節(jié)溶液的pH值，使其在反應過程中保持在10±0.5。完成滴定后，保溫繼續(xù)反應24 h，然后在常溫下靜置陳化24 h，用去離子水洗滌至pH值約為7.0，最后將沉淀物過濾、冷凍干燥即得以上3組實驗材料。

1.3 HE樣品和齲損的制備

據(jù)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第920醫(yī)院的標準程序，收集因正畸而拔除的18～45歲人群的第三磨牙。選用完整并且沒有齲損的人牙，用刀片去除牙齒表面的有機污物并切下根部，再用DTQ-5低速精密切割機切成長寬厚約為4 mm×3 mm×2 mm的釉質塊，用PMMA包埋釉質塊，在水冷金剛砂盤上將暴露的釉質唇拋光為鏡面狀表面，用體視顯微鏡檢查無明顯劃痕。處理好的釉質塊超聲處理1 min，浸入含有0.1 mol/L乳酸和3%羧甲基纖維素的乳酸脫礦凝膠中(pH=4.0)，使釉質的表面積與溶液的比率為2 mm2/mL，置于37 ℃恒溫箱中進行脫礦處理12 h，再用去離子水反復沖洗樣品并進行超聲處理1 min，處理好的樣品儲存在4 ℃的PBS中備用。

1.4 CCK-8法測定細胞毒性

采用CCK-8法，測定上述所制備材料對第3代293T細胞的毒性。制備濃度為0.05～0.4 g/mL的待測材料浸提液，與密度為5.0×104個/孔的293T細胞共同培養(yǎng)48 h，然后將10 μL CCK-8溶液加入到每個孔中，繼續(xù)溫育4 h，在波長為450 nm下測量每個孔的光密度(OD)。相對細胞活性(RCV)按以下公式計算：

(1)

式中：ODt、ODn和OD0分別為含有材料浸提液的孔，不含材料的孔(陰性對照)和沒有細胞的孔(空白對照)的平均光密度值。每種濃度材料測量8個孔的OD值，使用平均值±標準偏差表示。

1.5 HE樣品表征

脫礦HE樣品的再礦化方法和流程與課題組已發(fā)表文章[23]相同。采用配備EDX能譜的FEI Nova NanoSEM 450型場發(fā)射掃描電鏡表征HE的表面和剖面形貌及表面元素組成。采用PANalytical Empyrean型X射線衍射儀測定HE表面成分結構，測試條件為如下：Cu Kα(λ=0.154 06 nm)，掃描角度2θ=20°～70°，步長0.02°，電流40 mA，電壓40 kV。采用THV-30MD型顯微硬度儀，測定9.8 N載荷下HE樣品表面顯微硬度(SMH)，保荷時間為15 s。測定3個時間點(脫礦前MH0、脫礦后MH1和再礦化后MH2)，測量樣品表面間距200～300 μm的三個點并計算平均值。將HE樣品的SMH按從大到小排列，根據(jù)平衡分布原理將樣品均勻分為3組(n=6)。

2 結果與討論

2.1 復合材料的細胞毒性分析

圖1為HA、Gly/GO/HA和Asp/GO/HA的細胞毒性對比圖。參照GB/T 16886.5—2017《醫(yī)療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》，不含AA/GO的HA在測試濃度范圍內，細胞毒性為0級或1級；Gly/GO/HA和Asp/GO/HA的細胞毒性均為0級。與劉繼濤等[23]制備的GO/HA復合材料相比，AA分子的引入顯著提高了復合材料的細胞相對活性(RCV)值，表明AA/GO復合改性HA具有較高的安全性和生物相容性。

圖1 復合材料對細胞相對活性的影響Fig.1 Effect of the composites on relative cells viability

2.2 HE表面形貌分析

圖2為再礦化前/后HE表面的FESEM照片。由圖2(a)可知，拋光HE表面密實完整。經酸蝕處理后HE表面暴露出了部分的釉柱間隙，表面脫礦比較明顯(見圖2(b))。再礦化處理后，不含AA/GO的HA材料對酸蝕HE表面的修復作用有限，可以清晰地看出鱗片狀的釉柱形貌(見圖2(c))，從左下角的高倍FESEM照片可以看出，HE表面的空腔是HA利用納米顆粒的吸附性填充的，因此在釉質表面形成了不太緊密的礦化層。圖2(d)為Gly/GO改性HA復合材料處理組，HE表面生成了致密的再礦化層，并且吸附了少量的棒狀晶體顆粒。圖2(e)為Asp/GO改性HA復合材料處理組，HE表面形成了不連續(xù)的再礦化層，從左下角的高倍放大圖可以看出，再生的晶體具有不規(guī)則的形狀。綜上可知，Gly/GO/HA對酸蝕HE表面的修復效果優(yōu)于HA和Asp/GO/HA。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能為：Gly的引入降低了HA晶體的穩(wěn)定性，使Gly/GO/HA再礦化溶液能提供更多鈣離子，促進了酸蝕HE表面新的HA晶體生成，并促進新生晶體沿有利于整體表面能降低的c軸有序生長。同時，Gly/GO/HA中的GO片層具有豐富的含氧活性基團，也可以有效促進HA的成核和結晶。由于Asp帶負電，對HA表面的親和力較高，可能會抑制HA晶體的生長。此外，含Asp的Asp/GO/HA顆粒由于缺少顯著的表面電荷，導致其混懸液的穩(wěn)定性較差，容易沉淀至再礦化溶液底部，使其對齲損HE表面的修復效果較差。

圖2 再礦化前/后HE表面的FESEM照片：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.2 Surface FESEM images of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.3 HE剖面形貌分析

圖3為再礦化前/后HE剖面的FESEM照片。由圖3(a)可知，拋光HE剖面較致密。經酸蝕處理后，HE剖面暴露出約15 μm深的釉柱間隙，并且有更多的釉質棱晶暴露出來，脫礦比較明顯(見圖3(b))。再礦化處理后，不含AA/GO的HA(見圖3(c))對酸蝕HE深層的修復作用有限，仍可清晰看到釉柱間隙和暴露的釉質棱晶。Gly/GO/HA對HE深層脫礦的修復作用如圖3(d)所示，再礦化后HE的剖面完整致密，從高倍放大圖可以看出有大量細小的晶粒生成。結合圖2(d)可知，在Gly/GO的協(xié)同作用下，HA復合材料對酸蝕HE表面和深層脫礦均具有良好的修復作用。Asp/GO/HA處理組見圖3(e)，深層的脫礦區(qū)域仍有明顯的缺陷，高倍放大圖中可見許多釉質棱晶暴露出來，說明其對酸蝕HE深層的修復較差，進一步驗證了2.2中的分析。

圖3 再礦化前/后HE剖面FESEM照片：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.3 Cross-section FESEM images of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.4 HE表面元素分析

HE表面元素組成分析如表1和圖4所示。由圖4(a)可以看出，拋光的HE表面n(Ca)/n(P)為1.64(經驗衍生的HA為1.67)，說明HE主要由結晶度良好的HA晶體組成。由圖4(b)可以看出，經過12 h酸蝕處理后，HE表面n(Ca)/n(P)降為1.56，且Ca元素的占比有一定降低。由圖4(c)可知，再礦化處理后，不含AA/GO的HA使n(Ca)/n(P)恢復到1.61，這一結果可能更多反映了吸附在酸蝕HE表面的HA晶體的n(Ca)/n(P)。由圖4(d)和(e)可知，Gly/GO/HA和Asp/GO/HA使酸蝕HE表面的n(Ca)/n(P)分別恢復至1.59和1.57，均高于酸蝕處理后的n(Ca)/n(P)值(1.56)。說明這兩種復合材料均對酸蝕HE有修復作用，前者的修復作用優(yōu)于后者，與前述實驗結果一致。HE表面n(Ca)/n(P)摩爾比如表1所示。

表1 HE表面Ca/P摩爾比Table 1 Ca/P molar ratio of the human enamel surface

圖4 再礦化前/后HE表面EDS圖譜：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.4 Surface EDS patterns of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.5 HE表面成分結構分析

圖5為再礦化前/后HE表面的XRD圖譜。圖5(a)為拋光HE，圖5(b)為酸蝕處理后的HE，可以看出酸蝕后釉質表面的衍射峰明顯弱化，說明酸蝕會顯著降低HE表面HA晶格的完整性。再礦化處理后，圖5(c)、(d)和(e)的晶面衍射峰均有不同程度的恢復，說明酸蝕部位均得到了一定程度的修復。其中Gly/GO/HA處理組(見圖5(d))的衍射峰強度最接近拋光牙釉質，表明Gly/GO/HA對HE表面晶體的修復作用優(yōu)于HA和Asp/GO/HA。

圖5 再礦化前/后HE表面XRD圖譜：(a)拋光；(b)酸蝕；(c)HA；(d)Gly/GO/HA；(e)Asp/GO/HAFig.5 Surface XRD patterns of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) acid-etched; (c) HA; (d) Gly/GO/HA; (e) Asp/GO/HA

2.6 HE表面力學性能分析

圖6為再礦化前/后HE的SMH圖。經酸蝕處理后，HE的SMH均值從353.89 HV降低至約75 HV。通過單因素方差分析顯示，脫礦后各實驗組樣品的SMH沒有顯著性差異(p>0.05)。盡管三組材料均使酸蝕HE的SMH得到一定恢復，且彼此之間無顯著差異(p<0.05)，但仍遠低于拋光HE，表明各組實驗材料對HE的表面力學性能修復作用有限。HE精密的層級結構和有機物賦予的獨特增韌機制[13]，使其具有高硬度、高韌性等特殊力學性能。經酸蝕處理12 h后，HE的精密層級結構可能已被酸蝕破壞，導致再礦化后HE的SMH難以恢復至正常水平。

圖6 再礦化前/后HE的SMH圖：(a)拋光；(b)HA；(c)Gly/GO/HA；(d)Asp/GO/HAFig.6 SMH of the HE before/after remineralization: (a) polished; (b) HA; (c) Gly/GO/HA; (d) Asp/GO/HA

3 結 論

(1)細胞毒性實驗結果表明，Gly和Asp分別與GO復合改性HA，可顯著提高材料浸提液的相對細胞活性，說明Gly/GO/HA和Asp/GO/HA具有較高的安全性和生物相容性。

(2)經Gly/GO/HA處理后，酸蝕HE表面及深層脫礦均得到良好修復。Gly的引入使HA沿c軸有序生長，GO片層上附著的豐富的含氧活性基團，進一步促進了HA的成核和結晶。Asp/GO/HA的再礦化效果較弱，帶負電的Asp對HA表面親和力較高，可能會抑制HA晶體的生長。此外，含有Asp的HA顆粒不易形成穩(wěn)定的混懸液，使Asp/GO/HA無法有效修復酸蝕HE。

(3)HE表面元素、成分結構分析表明，Gly/GO/HA對酸蝕HE表面的修復作用優(yōu)于Asp/GO/HA和HA。力學性能分析表明，各組材料對酸蝕HE的表面顯微硬度修復作用有限，可能是由于新生成的礦物層缺少HE原有的精密層級結構，對其SMH值的恢復造成了一定的影響。