馬牧溪，張發(fā)財,2，馬洪貴,2，鐘渠梁,2，胡 歡，吳志平,3

（1.貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州貴陽 550000；3.黔南州人民醫(yī)院泌尿外科，貴州都勻558000）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是起源于尿路上皮的惡性腫瘤，以移行細胞癌最為常見，在全世界所有類型癌癥的發(fā)病率排名第10 位[1]。根據(jù)統(tǒng)計報告，2016 年我國膀胱癌新發(fā)8.5 萬例，死亡人數(shù)3.29萬[2]，是我國癌癥死亡的第九大原因[3]。BC 的治療方案包括手術切除、放化療及免疫輔助等，盡管這些治療取得了顯著進展，但是其有較高的復發(fā)或進展可能，約40% 的患者經(jīng)歷了多次復發(fā)[4]。

2012 年，DIXON 等[5]率先報道了這種鐵依賴性脂質過氧化驅動的，區(qū)別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型氧化調節(jié)細胞死亡，并將其命名為“鐵死亡”。鐵死亡由3 個基本標志定義：①含多不飽和脂肪酸的膜磷脂的氧化；②氧化還原活性鐵的可用性；③脂質過氧化氫修復能力的喪失[6]。鐵死亡在人類生理發(fā)育、體內微環(huán)境平衡以及疾病中起著重要作用[7]，在生理和病理狀態(tài)下，各種內外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現(xiàn)的全身性非特異性適應反應均可引起鐵死亡[5]。因此鐵死亡與臨床疾病密切相關，如癌癥、腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷[8-10]。近年來有大量文獻報道，鐵死亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展扮演著不同角色[11-14]。因此利用鐵死亡的抑癌機制，努力尋找膀胱癌的新型靶向治療策略。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，在生物過程中發(fā)揮著廣泛的功能，包括細胞生長、抗凋亡、遷移和侵襲[15]。研究表明lncRNA 參與了膀胱癌發(fā)生發(fā)展和轉移[16-18]，而這些研究主要針對膀胱癌的單個或幾個lncRNA。雖然鐵死亡具有抑癌機制，但導致膀胱癌細胞的鐵死亡機制尚未完全驗證。因此我們利用癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫基于鐵死亡相關的lncRNA 構建膀胱癌預后模型，尋找膀胱癌預后分子生物標志物并評估患者預后，為膀胱癌患者靶向治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與樣本整理從TCGA 數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載膀胱癌的RNA 測序(RNA-seq)數(shù)據(jù)。納入標準如下：①發(fā)病部位：膀胱；②患者有完整的lncRNA 數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。并通過Perl 軟件對轉錄組數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理、ID轉換、分離lncRNA 和mRNA；在篩選臨床數(shù)據(jù)時，排除了生存時間＜30 d 的樣本和正常樣本。TCGA 數(shù)據(jù)庫的3 級數(shù)據(jù)是免費且公開的，因此不需要倫理委員會的批準。

1.2 lncRNA 與鐵死亡相關基因的篩選鐵死亡相關基因從MsigDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）下載，并在TCGA 數(shù)據(jù)庫中提取在膀胱癌中表達的基因，通過R 軟件對lncRNA 和鐵死亡相關基因進行Pearson相關性計算篩共篩選鐵死亡相關的lncRNA，設置過濾標準：相關系數(shù)的平方｜r2|＞0.3；P＜0.001。

1.3 預后基因的篩選及模型的構建首先，通過單因素Cox回歸分析（過濾標準：P＜0.05）初步篩選與BC 患者預后有關的目標lncRNA；再次進行Lasso回歸進一步篩選分析以減少數(shù)據(jù)的過度擬合，篩選關鍵的且與鐵死亡相關的lncRNA。Lasso回歸使用交叉驗證進行參數(shù)的選擇，并繪制Lasso回歸系數(shù)譜，最后進行多因素Cox回歸分析建立對BC 預后有價值的鐵死亡相關lncRNA 模型并以列線圖形式展示。根據(jù)多因素Cox回歸分析構建lncRNA 的風險評分方程為：

1.4 預后風險模型的評估及臨床價值分析首先利用模型公式計算樣本的風險值，根據(jù)中位值將樣本分為高低風險兩組進行生存差異分析，并繪制Kaplan-Meier曲線、1、3、5 年的多指標的受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線、風險熱圖以及風險打分等評估該模型預測患者生存的能力，然后將Risk score 與臨床數(shù)據(jù)合并后進行獨立預后分析，證明該模型是否可以獨立于其他臨床性狀，作為BC 患者的獨立預后因子，最后通過臨床因素的風險評分對臨床數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.5 共表達網(wǎng)絡構建及功能分析通過Cytoscape軟件（3.7.1 版）繪制鐵死亡基因與lncRNA 的共表達網(wǎng)絡，并評估m(xù)RNA 與lncRNA 之間的線性關系，利用GSEA 軟件對具有預后價值的鐵死亡lncRNA 相關的mRNA 行GO 和KEGG 富集分析其功能及參與的通路并繪制多GSEA 組圖對分析結果可視化。

2 結 果

2.1 lncRNA 數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)整理共下載430 個膀胱癌的RNA-seq 數(shù)據(jù)和409 個臨床數(shù)據(jù)，通過對數(shù)據(jù)的整理得出癌旁正常組織樣本：19；腫瘤樣本：411。納入臨床數(shù)據(jù)具體如下：不限種族(包括白人、黑人、亞洲人等)；年齡34～90 歲；不區(qū)分病理分級及臨床分期。通過Perl對RNA-seq數(shù)據(jù)整理共得到14 142個lncRNA。

2.2 lncRNA 與鐵死亡相關基因的篩選登錄Msig-DB 數(shù)據(jù)庫共下載60 個鐵死亡相關的基因，在TCGA數(shù)據(jù)庫中共提取59 個在膀胱癌表達的基因，利用R 軟件通過鐵死亡基因-lncRNA 共表達方法對59 個鐵死亡基因與14 142 個lncRNA 進行篩選，共確定1 796個鐵死亡相關的lncRNA。

2.3 預后基因的篩選及模型的構建首先，通過單因素Cox回歸分析（過濾標準：P＜0.05）初步篩選出180 個BC 患者預后有關的目標lncRNA。再將初篩變量進行Lasso回歸進一步篩選分析以減少數(shù)據(jù)的過度擬合，篩選出28 個對預后更有價值的鐵死亡相關的lncRNA，并繪制Lasso回歸系數(shù)譜(圖1A、B)。

圖1 利用Lasso 模型篩選自噬相關的lncRNA

然后進行多因素Cox回歸分析篩選出14 個與BC患者有預后價值的鐵死亡相關lncRNA 并以森林圖形式展示(圖2A)。并且繪制14 個目標lncRNA 與鐵死亡相關基因及BC 患者總生存期關系的桑葚圖(圖2B)。最后14 個鐵死亡相關的lncRNA 構建BC 預后模型。風險評分方程：Risk score=（-0.35992×AC 0 6 2 0 1 7.1）+（-0.3 5 2 9 5×O C I A D 1-A S 1）+（-0.3 1 5 8 8×A L 0 3 1 7 7 5.1）+（-0.2 1 4 5 9×AC018653.3）+（-0.13950 ×LINC01767）+（ -0.12690+LINC01560） + （ -0.12387×USP30-AS1）+（-0.05630×AL354919.2）+（-0.04813×LINC01871）+（0.01493×LINC00942）+（0.05279×MAFG-DT）+（0.12833×LINC02321）+（0.18432×AL136084.3）+（0.21681×AL049840.3）。

圖2 多因數(shù)Cox 回歸分析篩選構建風險比例模型的鐵死亡相關基因

2.4 預后風險模型的評估及臨床價值分析首先對模型中的14 個lncRNA 進行單因素回歸分析并繪制生存曲線。其次對高低風險組兩組進行生存差異分析，通過K-M 生存曲線、風險評分圖、生存狀態(tài)圖、風險熱圖結果顯示隨著風險評分的增加，患者的死亡率逐步上升，低風險組的總生存期明顯優(yōu)于高風險組，高低風險兩組明顯存在生存差異（P＜0.001），風險評分對BC 患者的預后有顯著影響（圖3A、B、C、D）。然后患者1 年、3 年和5 年生存期的多指標ROC 曲線下面積分別為0.785、0.802、0.827（圖4）。說明該模型具有較好的預測生存能力。

圖3 高低風險分組膀胱癌患者的K-M 生存曲線及風險模型

圖4 膀胱癌患者多指標ROC 曲線

為了更好探究預后模型的臨床價值，對風險評分與患者的臨床數(shù)據(jù)（年齡、性別、腫瘤分期）進行單因素和多因素獨立預后分析，單因素Cox回歸顯示年齡、分期及總風險評分是獨立預后指標（圖5A），而多因素獨立預后分析顯示分期和風險評分以獨立于其他臨床因素，作為BC 患者的獨立預后因子（圖5B）。并且將風險評分納入臨床因素，繪制BC 患者的生存列線圖，C 指數(shù)：0.751（圖6A）。校準圖顯示預測概率與實際概率基本一致（圖6B、C、D）。最后對臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)風險評分隨腫瘤的分期增加而升高（表1）。上述結果表明，基于14 個鐵死亡相關的lncRNA 的所構建的預測模型在預測BC 患者預后方面明顯優(yōu)于年齡、性別及腫瘤分期等臨床因素，并且風險評分與BC 的進展顯著相關。

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中BC 數(shù)據(jù)風險評分的臨床影響

圖5 膀胱癌患者獨立預后分析

圖6 胱癌患者的生存列線圖及多年份的校準圖

2.5 共表達網(wǎng)絡構建及功能分析Cytoscape 軟件構建鐵死亡基因與lncRNA 的共表達網(wǎng)絡見圖7。通過線性分析發(fā)現(xiàn)mRNA 與lncRNA 之間存在線性關系。在功能富集分析中共獲得2 087 個GO 項（2 020個高風險組上調通路及67 個低風險組下調通路）和60 個KEGG 路徑（54 個高風險組上調通路及低風險組6 下調通路）。在高風險組發(fā)現(xiàn)，在GO 分析中鐵死亡相關的lncRNA 主要富集在上皮細胞向間充質細胞轉化的正調控、上皮細胞向間充質細胞轉化、上皮層的形態(tài)發(fā)生、細胞連接組件等生物過程；而在KEGG富集中主要集中在焦點粘連、致心律失常性右心室心肌病、細胞外基質受體相互作用、肌動蛋白骨架調節(jié)、肥厚性心肌病、WNT 信號通路、癌癥信號通路等。高風險組的前5 個路徑見圖8。

圖7 膀胱癌預后lncRNA 與鐵死亡相關基因之間的網(wǎng)絡圖

圖8 高風險組多基因集富集分析組圖

3 討論

BC 是泌尿系統(tǒng)最常見的癌癥之一，對男性的影響僅次于前列腺癌。雖然BC 的診斷及治療在臨床工作中已經(jīng)取得確切的療效，但是患者術后復發(fā)率高且有進展可能，沒有特異的生物學指標，因此探索BC 新生物標志物篩選高危人群，早期對這類人群行個體化治療，以提高膀胱癌的生存率。鐵死亡是新近認識的一種鐵依賴性的細胞程序性死亡，鐵死亡和很多疾病關系密切[19]。隨著人類基因組測序數(shù)據(jù)的不斷進步，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了lncRNA 在腫瘤的診斷、治療以及預后等方面發(fā)揮著不可缺少的作用[20-22]。就目前而言，大多數(shù)研究多集中在單個lncRNA，針對鐵死相關的基因報道較少[23]，因此基于TCGA 數(shù)據(jù)庫建立鐵死亡相關的lncRNA 來預測膀胱癌患者的預后，尋找新的生物學標志物，對高風險人群進行個體化治療。

本文中，通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫樣本的整理和鐵死亡相關基因的篩選，利用多因數(shù)Cox回歸分析共獲得14 個對BC 患者有預后價值的鐵死亡相關lncRNA，其中LINC00942 在腎透明細胞癌中，通過與miR-3139 的相互作用調控腫瘤增殖和轉移，進而影響患者的生存和預后[24]，同樣LINC00942 通過介導N6－甲基腺嘌呤促進乳腺癌的增值和進展，可以為乳腺癌的治療提供新思路[25]，MAFG-DT 可以作為腫瘤浸潤性B 淋巴細胞對BC 的預后以及免疫治療有著潛在影響[26],在清亮亮等[27]研究表明，LINC02321 對BC 細胞的侵襲和遷徙有著顯著影響, AL049840.3、AL031775.1 可能通過上皮間質的轉換影響B(tài)C 患者的 預 后 和 進 展[28]，OCIAD1-AS1 和AL354919.2 在BC 組織中高表達，與患者的預后顯著相關，可以作為BC 的預后標志物[29]，在夏陽等[30]有關結直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LINC01560 在腫瘤中高表達腫與患者的TNM 分期有著密切聯(lián)系，可為該疾病的診斷和治療提供新方向，在宮頸癌中USP30-AS1 通過競爭并抑制miR-229-3p 過表達IVA 型蛋白酪氨酸磷酸酶促進腫瘤的進展[31]，在有關生物信息學研究，LINC01871 在乳腺癌、胃癌、子宮內膜癌中均有報道[32-34]，而目前，剩余的4 種鐵死亡相關的lncRNA（AL136084.3、AC062017.1、AC018653.3、LINC01767）尚未在癌癥中有所報道，因此需要更多的學者對其意義進行探索?；?4 個鐵死亡相關的lncRNA 構建的膀胱癌預后模型，在對TCGA 數(shù)據(jù)庫BC 樣本進行生存分析中顯示低風險組的OS 明顯優(yōu)于高風險組，從生存狀態(tài)和風險評分圖可以看出隨著風險值的增加，死亡患者的數(shù)量越來越多，風險評分也越來越高。根據(jù)繪制1 年、3 年和5 年的ROC 曲線、C 指數(shù)和 校準圖反映該模型對預測BC 預后具有較高的準確性，可以為臨床研究提供潛在的方向，在之前的研究中也證實了這一觀點[35]。

富集分析表明，在高危組中主要富集在腫瘤、代謝、缺氧等相關通路過程顯著富集，已有研究表明在焦點粘連通路中抑制黏著斑激酶酪氨酸磷酸化或者通過敲除黏著斑激酶可抑制膀胱癌的侵襲和轉移[36]，細胞外基質的重組是癌細胞遷移的重要條件，已知細胞外基質受體相互作用在BC 的生長和耐藥性已有報道[37]，WNT 家族蛋白Wnt7a 通過激活經(jīng)典Wnt 通路（Wnt/β-catenin 信號傳導）促進BC 細胞的侵襲[38]。目前，很遺憾的是沒有確鑿的證據(jù)表明鐵死亡與BC的發(fā)生有直接的關系，但是通過此次的研究有助于我們探索鐵死亡相關的lncRNA 的機制。

本研究是基于TCGA 數(shù)據(jù)集進行回顧性的分析，樣本來源單一，分析結果可能存在偏差；最后本次有關鐵死亡相關lncRNA 的研究缺乏臨床實驗驗證結果，但是我們會在下一步進行有關基因的表達及l(fā)ncRNA 功能的實驗進行 驗證。

盡管存在上述缺點，但與傳統(tǒng)的病理分期相比，基于鐵死亡相關的lncRNA 構建膀胱癌預測模型能夠更準確的預測BC 的總生存率。通過該模型可以準確的篩選BC 的高危人群，為這類人群的個體化治療提供重要的參考依據(jù)，并為后續(xù)的臨床工作、實驗開展提供研究方向和理論基礎。