楊 倩, 包濤濤,2, 鮮思美,3, 張 友, 梁 倩, 顧慶林

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省黔東南州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 黔東南 556000； 3.貴州省動(dòng)物疫病研究室，貴州 貴陽 550025)

羔羊睪丸(lamb testicular, LT)細(xì)胞適用于多種病毒的增殖，如山羊痘病毒(goatpoxvirus, GTPV)、綿羊痘病毒(sheeppoxvirus, SPPV)以及羊口瘡病毒(orf virus, OrfV)等[1-3].其中，OrfV屬于痘病毒科副痘病毒屬成員，其分布于全球范圍內(nèi)，在許多國(guó)家流行[4-6].OrfV主要侵害宿主的皮膚和黏膜，造成嚴(yán)重的持續(xù)性感染和繼發(fā)性感染，對(duì)泌乳母羊和新生羔羊危害極大，會(huì)給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8].OrfV在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，形成了一套獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)策略，以此庇護(hù)種群復(fù)制和免疫逃逸[9].早在1959年，Plowright et al[10]就利用LT細(xì)胞成功地對(duì)OrfV進(jìn)行了分離.但是到目前為止，OrfV與宿主互作的具體機(jī)制仍未明確.

cDNA文庫是研究基因組學(xué)的基本工具之一，它是以組織或細(xì)胞的mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA(ds cDNA)后，與適當(dāng)?shù)妮d體連接并轉(zhuǎn)化至受體菌，包含細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆子群即為該組織或細(xì)胞的cDNA文庫[11].目前，常用的載體為噬菌體或質(zhì)粒載體.對(duì)于真核細(xì)胞來說，cDNA文庫是已經(jīng)去除了內(nèi)含子的cDNA，比基因組DNA文庫小很多，因此，易從中篩選和克隆到所需要的目的基因.cDNA文庫主要包括經(jīng)典cDNA文庫、標(biāo)準(zhǔn)cDNA文庫、酵母雙雜交cDNA文庫、差示cDNA文庫、限制性cDNA文庫等.近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，構(gòu)建cDNA文庫的方法在逐漸改進(jìn)，主要有Cap-trapper、Cap-jumping、Oligo-capping及SMART法等[12].其中，SMART法較其他方法便捷，其無需分離、純化mRNA，且得到的cDNA為全長(zhǎng)cDNA.

基于此，本研究采用SMART技術(shù)合成ds cDNA，通過同源重組的方法將cDNA克隆至編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)的pGADT7-Rec載體，以此構(gòu)建LT細(xì)胞的酵母雙雜交cDNA文庫，旨在為進(jìn)一步篩選OrfV與LT細(xì)胞的互作蛋白及其互作機(jī)制的研究提供生物材料.

1 材料與方法

1.1 材料

羔羊睪丸組織由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào):C11875500BT)、胰酶(貨號(hào):25200056)均購自Gibco公司，胎牛血清(貨號(hào):11011-8611)購自四季青公司，Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System試劑盒(貨號(hào):630490.內(nèi)含cDNA文庫構(gòu)建試劑盒、CHROMA SPINT TE-400純化柱、pGADT7-Rec載體、Y187菌株、YPDA培養(yǎng)基、SD/-Leu缺陷培養(yǎng)基以及酵母轉(zhuǎn)化試劑盒YeastmakerTMYeast Transformation System 2)、Advantage 2 PCR Kit(貨號(hào):639201)均購自Clontech公司.

1.2 LT細(xì)胞分離培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行LT細(xì)胞的分離培養(yǎng).將新采集的睪丸用滅菌的PBS反復(fù)洗滌3次后，放入盛有75%(體積分?jǐn)?shù))酒精的燒杯內(nèi)，數(shù)秒后取出并放入無菌平皿中；用滅菌的剪刀剪開睪丸的被膜、白膜，鈍性分離睪丸組織，盡可能地收集睪丸的實(shí)質(zhì)，滅菌PBS反復(fù)洗滌組織，直到?jīng)]有血絲為止；將組織剪為約5 mm3的碎塊后，加入約4倍體積的胰酶，倒入離心管內(nèi)，放入37 ℃水浴鍋中30 min，每隔10 min振蕩一次，4 000 r·min-1離心5 min，使組織和液體分離；棄上清液，把組織倒入50 mL的小燒杯中，取10 mL配好的含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液加入離心管中，用移液管反復(fù)吹打后，倒入小燒杯中，再反復(fù)吹打，使其細(xì)胞分散；將反復(fù)吹打的組織和液體經(jīng)滅菌的8層紗布過濾，濾液加入剩余的培養(yǎng)液，充分混勻；分裝，標(biāo)記，放入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)2代后用于后續(xù)細(xì)胞總RNA的提取.

1.3 LT細(xì)胞總RNA提取

待第2代LT細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次后收集細(xì)胞，采用Trizol法[13]提取細(xì)胞總RNA并測(cè)定其濃度(Thermo Fisher Scientific, NanoDrop One)，另取RNA樣本經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.4 cDNA第一鏈合成

按照文庫構(gòu)建試劑盒說明書，取1 μL總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈合成.

1.5 ds cDNA合成及純化

利用LD-PCR將cDNA第一鏈合成ds cDNA.反應(yīng)總體積為100 μL：cDNA第一鏈2 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 2 μL，50×dNTP Mix 2 μL，上、下游引物各2 μL，10×Advantage 2 PCR buffer 10 μL，10×Melting Solution 10 μL，dd H2O 70 μL.反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min(每個(gè)循環(huán)增加5 s)，總共24個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min.反應(yīng)完成后取7 μL產(chǎn)物經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

根據(jù)試劑盒說明書，利用CHROMA SPINT TE-400純化柱對(duì)LD-PCR擴(kuò)增得到的ds cDNA進(jìn)行純化，取2 μL純化后的ds cDNA經(jīng)1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.6 文庫構(gòu)建

用PEG/LiAc法[14]制備Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞.按照文庫構(gòu)建試劑盒說明書，利用同源重組方法，將18 μL ds cDNA、6 μL pGADT7-Rec(0.5 μg·μL-1)、20 μL Yeastmaker Carrier DNA(已變性)共轉(zhuǎn)化到Y(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞中，最后用15 mL生理鹽水重懸細(xì)胞.將轉(zhuǎn)化后的菌液全部涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d至菌落出現(xiàn).當(dāng)SD/-Leu培養(yǎng)基上鋪滿菌落時(shí)，4 ℃冷卻培養(yǎng)板4 h，每個(gè)平板中加入5 mL YPDA凍存液(含25%甘油的YPDA液體培養(yǎng)基)，用無菌玻璃棒刮下酵母菌落，收集的液體保存于-80 ℃.

1.7 文庫質(zhì)量評(píng)價(jià)

取10 μL文庫構(gòu)建得到的菌液，按102、104、106稀釋，分別取50 μL涂布于SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，對(duì)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)以計(jì)算文庫滴度和文庫容量.文庫滴度/(CFU·mL-1)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布體積；文庫總?cè)萘?CFU=文庫滴度(CFU·mL-1)×cDNA文庫總體積(mL).從SD/-Leu固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落中隨機(jī)挑取34個(gè)單菌落，用10 μL無菌去離子水重懸菌落，以該混懸液為模板，利用文庫載體pGADT7-Rec通用引物(上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′，下游引物5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′)對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)文庫重組率及多態(tài)性.

2 結(jié)果與分析

2.1 LT細(xì)胞的形態(tài)

圖1 分離的LT細(xì)胞(100×)Fig.1 LT cells isolated (100×)

在倒置顯微鏡(CNOPTEC, BDS400)下可觀察到分離的LT細(xì)胞貼壁后呈長(zhǎng)梭形(圖1).

2.2 LT細(xì)胞總RNA的提取

經(jīng)Trizol法提取的總RNA濃度為363.10 ng·μL-1，其D260 nm/D280 nm=1.90，D230 nm/D260 nm=1.88；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見3個(gè)條帶，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，亮度比接近2∶1，5S rRNA條帶亮度較弱(圖2).這表明提取的RNA樣本純度較高，具有良好的完整性，可用于后續(xù)cDNA文庫的構(gòu)建.

2.3 ds cDNA的合成及純化

經(jīng)LD-PCR擴(kuò)增后的ds cDNA呈現(xiàn)彌散狀分布(圖3)；經(jīng)CHROMA SPINT TE-400純化柱純化后,ds cDNA中小于250 bp的片段被去除，多處于250～2 000 bp(圖4).這表明純化后的ds cDNA豐度較高，符合建庫要求.

M.DL2 000 DNA marker; 1.總RNA樣品.圖2 LT細(xì)胞總RNA電泳分析Fig.2 Electrophoretic analysis of total RNA in LT cells

M.DL5 000 DNA marker;1.純化后的cDNA.圖4 純化后cDNA樣本電泳分析Fig.4 Electrophoretic analysis of cDNA samples after purification

2.4 文庫質(zhì)量

2.4.1 文庫滴度及總?cè)萘?102、104稀釋度平板上單個(gè)菌落不可計(jì)數(shù)，106稀釋度平板上3個(gè)重復(fù)的單個(gè)菌落數(shù)分別為12、12和11個(gè).由此計(jì)算出文庫滴度為2.33×108CFU·mL-1，文庫總?cè)萘繛?.5×109CFU.這表明文庫中克隆子數(shù)量滿足建庫要求，符合其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[15].

2.4.2 文庫重組率及多態(tài)性 從SD/-Leu固體培養(yǎng)基上隨機(jī)選取34個(gè)單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增陽性率達(dá)100%，文庫插入片段大小為250～2 000 bp，平均大小約為1 000 bp(圖5).34個(gè)單菌落均擴(kuò)增出特異性條帶，由此計(jì)算出文庫重組率達(dá)100%，且具有較好的多態(tài)性.這表明本研究構(gòu)建的cDNA文庫合格，可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗(yàn).

3 討論

Fields et al[16]發(fā)明了酵母雙雜交技術(shù)，此后該技術(shù)被不斷改進(jìn)與完善，已成為研究蛋白間相互作用的重要方法之一[17].酵母雙雜交技術(shù)巧妙地把復(fù)雜的蛋白互作研究轉(zhuǎn)換成簡(jiǎn)易的核酸研究，并能進(jìn)行大規(guī)模的蛋白篩選[18-19]；同時(shí)，該技術(shù)可捕捉到微弱、瞬時(shí)的蛋白互作，不需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純化等一系列繁瑣的操作，避免了如蛋白變性等引起的試驗(yàn)誤差，能更好地呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作的真實(shí)情況[20].

M.DL5 000 DNA marker;1～34.隨機(jī)挑取的單菌落.圖5 cDNA文庫菌落PCR檢測(cè)Fig.5 PCR detection of cDNA library colonies

OrfV感染引起的疾病降低了養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，并給世界公共衛(wèi)生安全帶來巨大隱患.已有多位學(xué)者構(gòu)建了酵母雙雜交cDNA文庫，并利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與OrfV互作的宿主細(xì)胞蛋白：Chen et al[21]通過構(gòu)建羊鼻甲骨細(xì)胞(primary ovine fetal turbinate cells, OFTu)cDNA文庫，利用酵母雙雜交技術(shù)成功篩選出與OrfV 002蛋白互作的宿主蛋白S100A4，并發(fā)現(xiàn)OrfV 002與S100A4相互作用可抑制NF-κB信號(hào)通路激活；Long et al[22]也通過構(gòu)建OFTu酵母雙雜交cDNA文庫，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出11個(gè)與OrfV 024互作的宿主細(xì)胞蛋白；Tian et al[23]通過構(gòu)建綿羊睪丸細(xì)胞(sheep testicular cells, STCs)酵母雙雜交cDNA文庫，成功篩選出5個(gè)能與OrfV 125蛋白互作的宿主細(xì)胞蛋白，其中，BIRC5能抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、參與有絲分裂.研究表明，OrfV接種于LT細(xì)胞并傳至17～36代后，活力仍達(dá)97%以上[3].鑒于OrfV在LT細(xì)胞上穩(wěn)定的增殖特性，本研究選擇構(gòu)建LT細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫.

cDNA文庫質(zhì)量的評(píng)估通常需要借助3個(gè)指標(biāo)，分別為文庫容量、文庫重組率以及插入片段大小.其中，文庫容量反映了cDNA文庫的覆蓋度，理論上一個(gè)覆蓋度完整的cDNA文庫容量至少為1×106CFU[15].本研究構(gòu)建的cDNA文庫滴度為2.33×108CFU·mL-1，文庫總?cè)萘繛?.5×109CFU，符合理論要求.重組率和插入片段大小反映cDNA序列的完整性，SMART法要求重組率大于85%，且插入片段的大小應(yīng)在200 bp以上[12,24].經(jīng)PCR檢測(cè)，本研究構(gòu)建的cDNA文庫重組率達(dá)100%，且多態(tài)性良好，插入片段大小為250～2 000 bp，符合SMART法的要求.