向 雙, 孫維紅, 萬曉會, 丁 樂, 韓國勇, 鄒雙全, 鄒小興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院，福建 福州 350001； 3.福州植物園，福建 福州 350000)

香樟(Cinnamomumcamphora)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物，是重要的自然生態(tài)樹種，也是寶貴的芳香植物資源，集香料、藥用、材用等多功能于一體[1].研究表明，其枝、葉、果均含有豐富的化學(xué)成分[2-5]，如黃酮類、糖苷類、揮發(fā)油、木脂素類等，具有抗癌止痛、驅(qū)蟲抑菌、抗氧化等多種藥理活性[6],利用價值高，開發(fā)意義大.香樟也是越南、韓國、日本、中國臺灣和大陸地區(qū)的間斷分布種.然而香樟種類繁多，有不同的化學(xué)型，引種混亂，給實際生產(chǎn)與利用帶來了挑戰(zhàn).研究不同香樟無性系的遺傳結(jié)構(gòu)，探討其親緣關(guān)系，對制定香樟種質(zhì)資源保護策略、指導(dǎo)優(yōu)良種質(zhì)資源篩選和相關(guān)優(yōu)異基因挖掘具有重要意義.

分子標記技術(shù)在研究不同品系間親緣關(guān)系和遺傳多樣性方面應(yīng)用廣泛[7]，包含簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR)[8]、相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism, SRAP)[9]、隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplifed polymorphic DNA, RAPD)[10]、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)[11]等標記方式.SNP(single nucleotide polymorphism)即單核苷酸多態(tài)性，是由單個核苷酸變異導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性.目前所有DNA分子標記中多樣性最為豐富的標記技術(shù)就是SNP標記，具有數(shù)量多、分布廣、代表性強、遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點[12].SNP標記近年來快速發(fā)展，已逐步成為遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳多樣性評價和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[13-16]的首選方法.本研究通過對香樟無性系及近緣種進行全基因組重測序開發(fā)SNP標記，解析了18份樟科資源(特別是16份香樟無性系)的親緣關(guān)系，探討不同無性系間的系統(tǒng)演化關(guān)系，為不同香樟無性系的鑒定評價以及進一步的收集和保存提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

收集永安林業(yè)苗圃14個福建選育的芳樟(Cinnamomumcamphoravar.inalooliferaFujita.)無性系，福建省中益制藥有限公司連城基地的1個四川宜賓油樟(C.longipaniculatum)、1個江西的龍腦樟(Cinnamomumcamphorachvar. Borneol)和1個肉桂(C.cassia)無性系，以及1個福建建甌的沉水樟(C.micranthum)，共18份無性系.于2019年7月采集所有樣品的嫩葉，用75%酒精和純水洗凈，經(jīng)液氮處理后，置于-80 ℃冰箱中保存.樣品名稱及來源見表1.

表1 樣品名稱及來源信息Table 1 Sample names and origins

1.2 基因組DNA提取

18份無性系基因組DNA的提取采用改良的CTAB方法[17]，以1.0%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用Nano-drop 2000紫外分光光度計(Thermo,美國)檢測DNA的純度和濃度.

1.3 測序與質(zhì)控

測序工作由華大基因完成，在全基因組水平上對樣品進行重測序分析.利用Trimmomatic軟件實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的質(zhì)控，將原始數(shù)據(jù)進行拆分、過濾.接頭序列、長度太短的序列以及低質(zhì)量讀段、N率較高的序列被濾除，最終獲得質(zhì)量高的讀段.

1.4 SNP標記篩選

以測序香樟基因組作為參考基因組，利用BWA[18]將序列比對到參考序列上，采用貝葉斯模型對參考序列存在的多態(tài)性位點進行篩選和過濾.利用ANNOVAR軟件對檢測篩選出的SNP進行功能注釋[19].

1.5 親緣關(guān)系分析

基于篩選的多態(tài)性SNP，使用MEGA 7[20]軟件構(gòu)建不同香樟無性系及近緣種的系統(tǒng)進化樹，采用NJ(neighbor-joining)算法[21]以及p-distance模型，bootstrap重復(fù)1 000次.不同種間的遺傳距離用系統(tǒng)進化樹的分支長度體現(xiàn)，長度越短即代表兩份種質(zhì)之間的親緣關(guān)系越近.使用Cluster軟件[22]對供試無性系進行主成分分析.

1.6 精油提取與成分分析

分別收集芳樟類群(編號1～11)混合葉、油樟類群(編號12～15)混合葉和龍腦樟(編號16)成熟健康、無病蟲害的葉片.香樟精油提取采用水蒸汽蒸餾法[23].稱取100 g香樟(芳樟、油樟或龍腦樟)葉鮮品，50 ℃下烘干至含水率為5%～13%，粉碎后置于500 mL揮發(fā)油提取器中，加入200 mL超純水加熱提取，提取時間為60～90 min.對提取出的芳樟精油進行GC-MS[24]分析，根據(jù)峰面積確定各化學(xué)組分的相對質(zhì)量分數(shù).色譜條件：初溫68 ℃，以15 ℃·min-1升溫至150 ℃，然后以5 ℃·min-1升溫至200 ℃，再以15 ℃·min-1升溫至280 ℃，進樣口溫度為250 ℃.進樣量為0.1 μL，載氣為氦氣.質(zhì)譜條件：EI離子源250 ℃，四級桿150 ℃;電子能量70 eV；電子倍增管電壓1 347 V，掃描質(zhì)量45～450 u.

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)

本次測序共獲得有效數(shù)據(jù)209 Gb.根據(jù)設(shè)定的過濾參數(shù)進行數(shù)據(jù)過濾，以香樟基因組作為參考基因組，利用BWA軟件比對序列，將所有的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組上.其中，基因組大小是720 Mb，雜合率為2.94%，重復(fù)率為62.77%，組裝完整度達到95.3%，參考基因組GC含量為40%.所有樣本的比對率較高，平均有效測序深度16 ×.從測序結(jié)果來看，數(shù)據(jù)準確，能滿足后續(xù)信息分析的要求.

2.2 SNP位點檢測

通過重測序檢測，18份無性系共獲得約209 308 831個高質(zhì)量SNP，其中，純合SNP共165 814 908個，雜合SNP共43 493 923個(表2).純合比率為62.49%～97.54%，平均值為79.67%；雜合比率為2.46%～37.51%，平均值為20.33%.

表2 香樟及近緣種SNP統(tǒng)計結(jié)果Table 2 SNP information of C. camphora and its related species

2.3 系統(tǒng)進化樹

基于不同香樟無性系的SNP標記用MEGA7軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1).近緣種肉桂首先被分離出來，之后是沉水樟.系統(tǒng)進化樹將16份香樟無性系分為龍腦樟、芳樟類群和油樟類群.11份芳樟無性系(包括香樟187號、香樟195號、香樟120號、香樟114號、建陽5號、漳浦1號、漳浦5號、漳浦6號、漳浦2號、漳浦4號和武平系香樟)聚在一起，說明其親緣關(guān)系較近.牡丹1號、鐵10、香樟209號與油樟聚在一起，說明其與油樟親緣關(guān)系較近.龍腦樟被單獨分為一類，在系統(tǒng)進化位置上靠近油樟類群.

2.4 主成分分析

主成分分析結(jié)果如圖2所示.香樟及近緣種被分為3個類群，其中類群1為11個芳樟無性系，對應(yīng)系統(tǒng)進化樹中的芳樟類群，其距離比較近，說明他們遺傳關(guān)系較近.肉桂也位于類群1，說明其與芳樟類群遺傳關(guān)系較近.類群2為牡丹1號、鐵10、香樟209號、油樟和龍腦樟，對應(yīng)系統(tǒng)進化樹中油樟類群和龍腦樟.類群3為沉水樟，與其他香樟無性系距離較遠，說明其遺傳關(guān)系較遠.油樟處在類群1與類群2之間，推測為種間雜交品系.主成分聚類結(jié)果與進化樹分析基本一致，說明其結(jié)果準確.

圖1 基于SNP構(gòu)建的香樟及近緣種系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of C.camphora and its related species based on SNP markers

2.5 精油化學(xué)利用類型

采用GC-MS對芳樟、油樟、龍腦樟3種化學(xué)型進行精油成分分析，結(jié)果顯示3種樟樹的精油成分有明顯差異(表3).芳樟精油中芳樟醇為主要成分，占比46.92%；油樟精油中桉葉油素為主要成分，占比30.31%；龍腦樟精油中樟腦為主要成分，占比46.28%.根據(jù)所測得的精油主要化合物及利用類型，分為3種化學(xué)型，分別為芳樟醇型、油樟型和樟腦型.SNP標記分類結(jié)果與精油成分的分類結(jié)果一致，驗證了結(jié)果的準確性.

表3 3種化學(xué)型樟樹精油的主要成分Table 3 Main components in essential oil of 3 groups of Cinnamomum

3 討論

香樟為樟科植物，亞熱帶闊葉樹種，在我國種植廣泛.根據(jù)其精油成分的種類與含量將香樟分為不同類型.另外，表型標記常被用來劃分植物類型，但易受環(huán)境影響，準確性不高[25].與表型標記相比，分子標記不受環(huán)境或生理因素影響，是評估植物親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)的有效工具[26].本研究基于全基因組重測序技術(shù)開發(fā)的SNP標記，解析不同香樟無性系的親緣關(guān)系，共獲得209 Gb原始數(shù)據(jù)，平均有效測序深度16 ×.共獲得約209 308 831個高質(zhì)量SNP，純合SNP共165 814 908個，雜合SNP共43 493 923個.

本試驗所用的1～14序號的香樟主要為福建選育的芳樟醇精油利用型，龍腦樟由江西引種，為樟腦利用型；油樟從四川宜賓引種，為桉葉油素利用型.從系統(tǒng)進化樹可知11份芳樟無性系聚在一起，3份芳樟無性系與油樟聚在一起，沉水樟先被分離出來.值得注意的是，牡丹1號、鐵10、香樟209號為閩選香樟，選育為芳樟醇精油利用型，但從親緣關(guān)系來看，其與油樟親緣關(guān)系更近.而邢建宏等[27]的研究表明，在猴樟、云南樟和油樟中，油樟與樟樹親緣關(guān)系最遠，這可能與油樟在演化過程中逐漸出現(xiàn)較大分化有關(guān)；也可能是在長期的繁衍過程中，雜交使得其組內(nèi)基因發(fā)生了改變[28].主成分分析同樣將16份香樟無性系分為3類，分別為芳樟類群、龍腦樟和油樟類群.而主成分分析顯示肉桂與芳樟類群有較近的親緣關(guān)系，但系統(tǒng)進化樹中肉桂先分化出來，并未與芳樟類群聚在一起.芳樟在進化過程中獨立成為分類學(xué)上的種[28]，但其可能保留了部分肉桂血緣. 系統(tǒng)進化樹與主成分分析和化學(xué)利用類型結(jié)果一致，反映了結(jié)果的準確性，為樟樹優(yōu)良無性系的選育提供了基礎(chǔ).張國防等[29]對樟樹不同化學(xué)型的研究也表明不同化學(xué)型樟樹樣本間的遺傳關(guān)系與其葉精油的主成分有一定的相關(guān)性，并且，他們也將芳樟型樣本歸入腦樟[30]，這與本研究中的部分閩選芳樟醇型與油樟聚在一起是一致的，原因在于不同化學(xué)型樟樹基因間的交流, 形成了復(fù)雜的遺傳關(guān)系.

4 結(jié)論

通過對16個香樟無性系和2個近緣種進行重測序分析，共獲得209 Gb原始數(shù)據(jù)，平均有效測序深度16×.共獲得約209 308 831個高質(zhì)量SNP，純合SNP共165 814 908個，雜合SNP共43 493 923個.從系統(tǒng)進化樹可知：11份芳樟無性系聚在一起，3份芳樟無性系與油樟聚在一起，然后與龍腦樟聚在一起，沉水樟和肉桂先被分離出來.主成分分析結(jié)果表明16份香樟無性系分為3類，分別為芳樟類群、龍腦樟和油樟類群；芳樟、龍腦樟和油樟精油成分存在差異，為不同的化學(xué)利用類型.