莊許諾, 陸芍華, 嚴夢涵, 何 晴, 包松英, 江興華, 王全溪 [1.福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室(福建農(nóng)林大學(xué))，福建 福州 50002； 2.中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建 福州 50002； .兆豐華生物科技(福州)有限公司，福建 福州 50014]

摘要: 選取10頭經(jīng)檢測確定為豬瘟抗原抗體雙陰性的斷奶外三元仔豬，隨機分為A、B組，每組5頭.A組(對照組)仔豬肌肉注射滅菌生理鹽水(1 mL·頭-1)，B組(兔脾淋組織注射組)仔豬肌肉注射兔脾淋組織(1 mL·頭-1).注射后的第3天，采集仔豬外周血，基于Illumina測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，篩選差異表達基因，進行基因本體(GO)及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)富集分析，并采用RT-qPCR驗證差異表達基因的表達水平.結(jié)果顯示：A、B兩組樣品的測序長度均約為6×109 bp，測序質(zhì)量符合要求；兩組外周血細胞共篩選到差異表達基因1 246個.GO富集結(jié)果表明，差異表達基因富集到的生物過程有56個GO條目，細胞組成有19個GO條目，分子功能有10個GO條目.KEGG富集結(jié)果表明，共有17條顯著性富集KEGG通路.本研究重點分析了A、B兩組樣品T細胞受體和Toll樣受體的KEGG通路，驗證差異表達基因的表達水平，結(jié)果顯示，與A組相比，B組CD4/8、TCRα、AP-1、NAFT基因的表達水平顯著上調(diào)，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致.以上結(jié)果表明，兔脾淋組織肌肉注射第3天可顯著影響豬外周血轉(zhuǎn)錄組譜，特別是可調(diào)節(jié)T細胞受體和Toll樣受體的KEGG通路，提高豬的免疫功能.

目前，豬瘟疫苗有兔化弱毒細胞苗、脾淋組織苗、E2亞單位苗等.豬瘟脾淋苗是豬瘟兔化弱毒苗的一種，于1954—1958年經(jīng)兔體繼代958代后獲得，并持續(xù)使用至今.豬瘟脾淋苗免疫72 h即可產(chǎn)生強大的免疫力，可在疫區(qū)對發(fā)病豬進行緊急免疫，并可有效控制疫情[1].豬瘟脾淋苗是將豬瘟兔化弱毒毒株接種于成年兔子，然后在無菌條件下采集兔子體內(nèi)含毒濃度最高的腸系膜淋巴結(jié)和脾臟，再將收集到的淋巴結(jié)和脾臟制備成疫苗[2].豬瘟脾淋苗與其他疫苗最大的區(qū)別是，該疫苗含有較多的兔脾淋組織.

兔脾淋組織對于豬瘟疫苗免疫效果具有一定的增強作用.如蔣冬福等[3]用1%兔脾淋組織稀釋豬瘟細胞苗，2周后檢測抗體水平，發(fā)現(xiàn)比用生理鹽水稀釋的豬瘟細胞苗，其抗體水平顯著性提高.可見，注射兔脾淋組織可以提高豬機體的免疫功能，從而提高豬瘟的免疫效果，但兔脾淋組織提高豬免疫功能的分子機制仍然需要進一步厘清.

對單一基因的表達進行分析不能完整地解釋某一機制，需要一次性對多個基因的表達進行分析，如果單純使用熒光定量PCR方法則費時費力.高通量測序快速準確，且可一次性大規(guī)模獲得轉(zhuǎn)錄本，近年來已在生物醫(yī)學(xué)研究上得到廣泛應(yīng)用.本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對注射兔脾淋組織3 d的斷奶仔豬外周血進行差異表達基因的篩選和分析，探究兔脾淋組織提高豬免疫功能的分子機制，旨在為該疫苗的使用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

兔脾淋組織由兆豐華生物科技(福州)有限公司提供，按豬瘟兔化脾淋苗標準生產(chǎn).

動物組織總RNA提取試劑盒、RT-qPCR試劑盒均購于蘭博利德試劑有限公司,Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于廈門泰京生物技術(shù)有限公司.

1.2 試驗動物的篩選

篩選無特定病原體的外三元健康哺乳母豬6～10頭，從母豬所產(chǎn)的28～30日齡仔豬中，選取10頭經(jīng)檢測確定為豬瘟抗原抗體雙陰性的仔豬進行下一步試驗.

1.3 試驗分組

將篩選出的仔豬隨機分為A、B兩組，每組5頭.A組(對照組)仔豬注射生理鹽水(1 mL·頭-1)，B組(兔脾淋組織注射組)仔豬肌肉注射兔脾淋組織(1 mL·頭-1)，第3天采集兩組豬外周血液，抗凝處理后，分離淋巴細胞送北京諾禾資源生物有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序.

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

提取樣品總RNA檢測純度，采用Illumina HiSeqTM2500系統(tǒng)測序獲得原始數(shù)據(jù)，檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量后進行基因表達差異分析.得到差異表達基因后，采用Cluster Profiler軟件的內(nèi)部函數(shù)完成基因本體(gene ontology, GO)富集分析及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析.首先將差異表達基因映射到各自的GO數(shù)據(jù)庫條目，然后計算每個條目的基因數(shù)量.將校正后的P≤0.05作為閾值，將滿足該條件的GO項定義為顯著富集.

KEGG是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫.將滿足Q≤0.05、P≤0.05的通路定義為差異表達轉(zhuǎn)錄本中的顯著性富集通路.

1.5 轉(zhuǎn)錄組RT-qPCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準確性，采用RT-qPCR方法對部分差異表達基因進行分析.首先采用總RNA提取試劑盒提取總RNA，將獲得的RNA按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄.逆轉(zhuǎn)錄體系為:2 μL 25 mmol·L-1MgCl2、1 μL GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶、4 μL GoScriptTM5×緩沖液、0.5 μL Recombinant RNasin?核酸酶抑制劑、1 μL Oligo(dT)引物、1 μL隨機引物、1 μL 10 mmol·L-1PCR Nucleotide Mix、3 μL mRNA，用無核酸酶水加至20 μL.將轉(zhuǎn)錄體系置于42 ℃反應(yīng)15 min，72 ℃反應(yīng)15 min.以獲得的cDNA為模板，進行RT-qPCR檢測.RT-qPCR循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共45個循環(huán).利用GraphPad Prism軟件計算差異表達基因的表達水平，各試驗重復(fù)3次.RT-qPCR所用基因的引物序列如表1所示.

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primers sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對照組的過濾后序列數(shù)占總序列數(shù)的93.10%，帶接頭的序列、帶N堿基的序列、測序質(zhì)量低的序列分別占總讀數(shù)的6.90%、0.00%、0.00%；試驗組的過濾后序列數(shù)占總序列數(shù)的93.38%，帶接頭的序列數(shù)、帶N堿基的序列數(shù)、測序質(zhì)量低的序列數(shù)分別占總序列數(shù)的6.68%、0.00%、0.00%:表明測序結(jié)果質(zhì)量良好，可以用于后期分析.

使用HISAT2軟件將過濾后的堿基數(shù)與參考基因組進行比對，獲取讀長在參考基因組上的定位信息.結(jié)果(表2)顯示，每頭豬均獲6×109以上的堿基數(shù)，Q30堿基百分比均大于90%，GC含量約為58%.差異表達基因的篩選結(jié)果(圖1)顯示，本研究共獲得1 246個差異表達基因，其中，上調(diào)的基因有685個，下調(diào)的基因有561個.

表2 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Transcriptome sequencing results

2.2 差異表達基因的GO富集結(jié)果

差異表達基因富集到的生物過程有56個GO條目，細胞組成有19個GO條目，分子功能有10個GO條目.結(jié)果(圖2)顯示：生物過程主要富集到酰胺生物合成過程、細胞酰胺代謝過程、肽代謝過程等10個，共有192個差異表達基因上調(diào)，57個差異表達基因下調(diào)；細胞組分主要富集到核糖體、胞質(zhì)核糖體、核糖體亞基等10個，共有191個差異表達基因上調(diào)，165個差異表達基因下調(diào)；分子功能主要富集到核糖體的結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)分子活性等10個，共有111個差異表達基因上調(diào)，69個差異表達基因下調(diào).

圖1 差異表達基因的篩選結(jié)果Fig.1 Differentially expressed genes screened

圖2 差異表達基因GO富集結(jié)果Fig.2 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.3 差異表達基因的KEGG通路富集結(jié)果

1 246個差異表達基因富集到的KEGG通路有289條，滿足P<0.05、Q<0.05的通路只有兩條，分別是核糖體、血小板活化；只滿足P<0.05的通路有17條(表3).

2.4 轉(zhuǎn)錄組的RT-qPCR驗證結(jié)果

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，隨機選取9個差異表達基因進行RT-qPCR分析.結(jié)果(圖3)顯示，RT-qPCR與轉(zhuǎn)錄組測序之間的差異表達基因的表達趨勢基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的質(zhì)量和可靠性是可以保證的.

表3 兔脾淋組織注射3 d后的KEGG通路富集結(jié)果Table 3 KEGG pathway analysis after injection of rabbit spleen and lymph tissue fluid for 3 days

2.5 與免疫功能相關(guān)的KEGG通路富集結(jié)果

圖3 9個差異表達基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與RT-qPCR數(shù)據(jù)的比較Fig.3 Comparison of RNA-seq data and RT-PCR data of 9 differentially expressed genes

對涉及到的289條KEGG通路進行了分析，發(fā)現(xiàn)與免疫功能相關(guān)的T細胞受體通路和Toll樣受體通路沒有達到顯著性富集，但通路中依然富集到差異表達基因.與未注射無毒兔脾淋組織的對照組相比，注射兔脾淋組織組的CD4/8、TCRα、CD3δ、NFAT、Raf、PKC、CARMA1、AP-1基因的mRNA水平顯著上調(diào)(附件圖Ⅰ、圖Ⅱ，掃OSID碼可見).

隨后采用RT-qPCR驗證了TCRα、CD4/8、AP-1、NFAT基因的表達情況.驗證結(jié)果(圖4)表明，兔脾淋組織注射3 d后，TCRα、CD4/8、AP-1、NFAT基因的mRNA水平顯著上調(diào)，其結(jié)果與KEGG通路中差異表達基因表達水平的趨勢一致.可見，兔脾淋組織注射3 d后，可上調(diào)TCRα、CD4/8、AP-1、NFAT基因的表達水平，提高機體免疫功能.

圖4 RT-qPCR對4個基因mRNA表達水平的驗證Fig.4 mRNA expression levels of differentially expressed genes in KEGG pathway by RT-qPCR

3 討論與結(jié)論

本次轉(zhuǎn)錄組測序是基于Illumina測序平臺的RNA 測序技術(shù)，可研究特定組織或細胞在某個時期轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA，是基因功能與結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)，對認知生物發(fā)育和疾病發(fā)生具有重要作用[4].轉(zhuǎn)錄組測序具備高通量、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，已成為轉(zhuǎn)錄組研究的主要方法.高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在挖掘差異表達基因，揭示生物基因表達及調(diào)控機理發(fā)揮了重要作用[5].本研究通過分析比較對照組和試驗組的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)有1 246個差異表達基因，其中，上調(diào)的基因有685個，下調(diào)的基因有561個.基因的上調(diào)和下調(diào)促使某些表達蛋白和因子分泌發(fā)生了變化，通過一系列的信號通路過程最終對機體產(chǎn)生重要影響[6].

豬瘟脾淋苗的主要成分是兔脾臟、淋巴結(jié)組織，脾臟和淋巴結(jié)既是免疫器管又為造血器官.本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因的主要功能與細胞、細胞組成、細胞器、細胞過程、代謝過程、炎癥、免疫相關(guān)；通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要在核糖體、血小板活化、趨化因子、人巨細胞病毒感染、T細胞受體、Toll樣受體等通路上.兔脾淋組織注射3 d后，其差異表達基因主要富集在血小板活化通路上，這與脾臟淋巴組織功能相吻合.

劉新平等[7]研究表明，健康兔脾淋組織液對豬瘟疫苗免疫抗體效價有明顯的增強作用.本研究結(jié)果也表明，兔脾淋組織對豬外周血中一些免疫相關(guān)基因的表達水平有明顯的促進作用，表明兔脾淋組織可以增強機體免疫力.NFAT基因是Ca2+依賴的轉(zhuǎn)錄因子，在T細胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[8].Chen et al[9]研究表明,刺激轉(zhuǎn)錄因子中的NFAT基因能抵抗機體的炎癥反應(yīng)，阻擋病原體，能有效地提高機體的免疫能力.T細胞受體作為T細胞識別抗原的分子在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[10]，TCR以非共價鍵的形式與CD3分子結(jié)合形成復(fù)合物，通過特異性識別并結(jié)合抗原提呈細胞或者靶細胞表面的抗原肽，啟動第一傳導(dǎo)信號，從而誘導(dǎo)T細胞活化并發(fā)揮適應(yīng)性免疫效應(yīng)的功能[11].

在Toll樣受體信號通路中的FOS(原癌基因)是上調(diào)的，F(xiàn)OS為c-fos基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的成熟mRNA編碼的一個核磷蛋白.C-fos基因是人或動物細胞中固有的正常基因，屬于即刻早期應(yīng)答基因.FOS作為一類核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細胞生長、分裂、增殖、分化乃至程序性死亡等方面具有重要作用[12].FOS蛋白與JUN蛋白組成的二聚體復(fù)合物AP-1，以磷酸化的c-JUN/c-FOS形式與基因序列上的AP-1結(jié)合位點結(jié)合[13]，在炎癥、腫瘤發(fā)生時AP-1是調(diào)節(jié)炎癥因子表達的重要轉(zhuǎn)錄因子[14].AP-1可通過與NFAT家族的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同激活不同的細胞類型參與調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)[15]，且NFAT/AP-1與DNA形成的三元復(fù)合物能激活細胞因子引起炎癥反應(yīng)；細胞因子也可以反向調(diào)節(jié)激活免疫應(yīng)答中的NFAT/AP-1復(fù)合物[16]，形成正反饋.

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析兔脾淋組織肌肉注射對豬外周血細胞轉(zhuǎn)錄譜的影響，同時關(guān)注了與免疫相關(guān)的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)兔脾淋組織能夠增強豬機體免疫功能，可能通過調(diào)節(jié)CD4/8、TCRα、AP-1等免疫相關(guān)基因的表達水平來影響T細胞受體和Toll樣受體的KEGG通路來調(diào)節(jié)機體免疫功能.