邱勇 李蒙 屈榕 田發(fā)君

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，診斷結(jié)核病最直接有效的方法就是從痰液中檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)痰樣本中MTB的方法以抗酸染色涂片和分枝桿菌培養(yǎng)法為主。抗酸染色涂片法簡(jiǎn)單方便，但陽(yáng)性檢出率低[3-4]。在培養(yǎng)法中，固體羅氏(L-J)培養(yǎng)法是目前國(guó)內(nèi)最常用的方法，其陽(yáng)性率較涂片高，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，需要4～8周。雖然自動(dòng)化液體培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間短于固體培養(yǎng)[5]，但其設(shè)備昂貴，通量高，不適合樣本量較少的縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室使用。手工液體培養(yǎng)法成本顯著低于自動(dòng)液體培養(yǎng)。本研究旨在采用分枝桿菌液體培養(yǎng)法(mycobacterium fast liquid medium，MFLM)進(jìn)行手工液體培養(yǎng)與中和離心固體培養(yǎng)法進(jìn)行比較，以評(píng)估手工液體培養(yǎng)法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、材料

1. 標(biāo)本來(lái)源：收集2018年7月1日至2020年12月31日在四川省武勝縣疾病預(yù)防控制中心(簡(jiǎn)稱(chēng)“疾控中心”)結(jié)核病防治門(mén)診就診的疑似肺結(jié)核患者首次就診時(shí)的痰標(biāo)本。

2. 儀器與試劑：N-乙酰-L半胱氨酸NaOH(NaOH-NALC)前處理液、中性固體羅氏培養(yǎng)基、分枝桿菌液體培養(yǎng)管、分枝桿菌熒光檢測(cè)儀(Myco Fast Ⅰ)均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，離心機(jī)為Eppendorf Centrifuge 5810，儀器與試劑均由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

二、研究方法

同時(shí)采用手工液體培養(yǎng)法和中和離心固體培養(yǎng)法對(duì)疑似患者的痰標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。具體步驟如下。

1. 標(biāo)本留?。洪T(mén)診就診的疑似肺結(jié)核患者將即時(shí)痰、夜痰和晨痰送至疾控中心，工作人員在痰盒上標(biāo)注患者信息，然后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

2. 標(biāo)本前處理和分離培養(yǎng)：將3份痰標(biāo)本混合后取2～5 ml于50 ml帶蓋的尖底離心管中，先用2倍體積NaOH-NALC前處理液消化20 min，加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)至50 ml，3000×g離心15 min，再棄上清液，沉淀用1 ml的pH值為6.8 PBS制備成約1.5 ml懸濁液；取1支MFLM培養(yǎng)管接種10滴(0.5 ml)懸濁液，取2支中性L(fǎng)-J培養(yǎng)管分別接種2滴(0.1 ml)懸濁液。2種培養(yǎng)管均置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3. 結(jié)果判定：按照《中國(guó)結(jié)核病防治工作技術(shù)指南》[6]和珠海貝索生物技術(shù)有限公司建議記錄了每個(gè)樣本的報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間。手工液體培養(yǎng)用分枝桿菌熒光檢測(cè)儀進(jìn)行判讀，接種后第2、3、7天判讀1次，以后每周判讀2次，6周末仍為陰性，則表示培養(yǎng)結(jié)果為陰性[7]。固體培養(yǎng)用肉眼觀察，接種后第3、7天觀察1次，此后每周觀察1次，8周末仍未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)為陰性[7]。對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行抗酸染色，抗酸染色陽(yáng)性則為陽(yáng)性，接著用對(duì)硝基苯甲酸(PNB)生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定，抗酸染色陰性則判斷為污染。對(duì)污染的液體培養(yǎng)物進(jìn)行去污染處理(加入2倍NaOH-NALC消化20 min)后進(jìn)行再培養(yǎng)，操作同上，若菌種鑒定結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌即統(tǒng)計(jì)為最終培養(yǎng)陽(yáng)性，否則記錄為污染。

4. 菌種鑒定：使用PNB進(jìn)行菌種鑒定。具體操作如下：(1)使用無(wú)菌吸管吸取生理鹽水加1滴至磨菌瓶中，用接種環(huán)刮取菌落至磨菌瓶中，仔細(xì)研磨均勻；(2)向磨菌瓶中加入生理鹽水，并通過(guò)加生理鹽水與麥?zhǔn)?號(hào)標(biāo)準(zhǔn)比濁度進(jìn)行比較，調(diào)節(jié)濁度，直至與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢?，即? mg/ml的菌液；(3)用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取2滿(mǎn)環(huán)1 mg/ml的菌液，移至2 ml 準(zhǔn)備的前處理管生理鹽水中，即稀釋成2～10 mg/ml菌液；(4)用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取1滿(mǎn)環(huán)2～10 mg/ml菌液，用劃線(xiàn)法均勻接種至鑒定培養(yǎng)基表面；(5)接種后培養(yǎng)基直立放于培養(yǎng)箱內(nèi)，36 ℃培養(yǎng)；培養(yǎng)4周后報(bào)告結(jié)果。

5. 質(zhì)量控制：陰性管不可重復(fù)使用；培養(yǎng)基、消化液等實(shí)驗(yàn)材料使用前檢查是否在有效期內(nèi)；實(shí)驗(yàn)室用水為儀器制備的UP等級(jí)水，經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌60 min，有效期為3 d。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間等非正態(tài)分布的資料均以“M(Q1，Q3)”描述，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間率的比較，通過(guò)一致性檢驗(yàn)的Kappa系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)兩種培養(yǎng)方法結(jié)果的一致性，培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性率比較

本研究共納入疑似肺結(jié)核患者1370例，對(duì)疑似患者的痰標(biāo)本進(jìn)行集菌法處理后分別進(jìn)行中和離心固體培養(yǎng)和手工液體培養(yǎng)。結(jié)果顯示中和離心固體培養(yǎng)法報(bào)告陽(yáng)性標(biāo)本274例，陽(yáng)性率為20.0%(274/1370)。手工液體培養(yǎng)法報(bào)告陽(yáng)性標(biāo)本353例，陽(yáng)性率為25.8%(353/1370)。手工液體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率高于中和離心固體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.907，P<0.001)，陽(yáng)性率提高了28.8%。對(duì)兩種培養(yǎng)方法的陽(yáng)性和陰性結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa系數(shù)為0.833(P<0.001)。兩種培養(yǎng)方法的結(jié)果見(jiàn)表1。分別統(tǒng)計(jì)兩種培養(yǎng)方法的污染情況。手工液體培養(yǎng)法共報(bào)告污染標(biāo)本153例，其中11例經(jīng)過(guò)去污染處理后再培養(yǎng)陽(yáng)性，污染率為10.4%(142/1370)。中和離心固體培養(yǎng)報(bào)告污染標(biāo)本144例，污染率為10.5%(144/1370)。

二、 兩種培養(yǎng)方法非結(jié)核分枝桿菌檢出率的比較

利用PNB對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行菌種鑒定，兩種培養(yǎng)方法共檢出41例(non-tuberculous mycobacterium，NTM)，其中手工液體培養(yǎng)法檢出38例，中和離心固體培養(yǎng)法只檢出13例，前者比后者多檢出25例，手工液體培養(yǎng)法檢出NTM的能力顯著高于中和離心固體培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.416，P<0.001)。

三、 兩種培養(yǎng)方法報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間的比較

手工液體培養(yǎng)法的中位報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間為2(2，3)周，2周及以?xún)?nèi)報(bào)告陽(yáng)性率為62.6%，4周及以?xún)?nèi)報(bào)告陽(yáng)性率為94.9%，手工液體培養(yǎng)法在第2周報(bào)告陽(yáng)性率最高，為38.8%(137/353)。中和離心固體培養(yǎng)法的中位報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間為3(2，4)周，3周及以?xún)?nèi)報(bào)告陽(yáng)性率為66.1%，6周及以?xún)?nèi)報(bào)告陽(yáng)性率為95.3%，中和離心固體培養(yǎng)法第3周報(bào)告陽(yáng)性率最高，為38.7%(106/274)(表2)。手工液體培養(yǎng)法的報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間顯著短于中和離心固體培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.491，P<0.001)。

表2 兩種培養(yǎng)方法報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間

討 論

為了評(píng)估手工液體培養(yǎng)法在基層(縣級(jí))結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用效果，筆者共納入本單位收治的1370例疑似肺結(jié)核患者，對(duì)其痰標(biāo)本分別進(jìn)行手工液體培養(yǎng)法和中和離心固體培養(yǎng)法，結(jié)果顯示手工液體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率更高，報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間更短，適合在基層實(shí)驗(yàn)室用于結(jié)核病的診斷。

手工液體培養(yǎng)法可以顯著提高M(jìn)TB的陽(yáng)性檢出率。在南非開(kāi)展的一項(xiàng)研究通過(guò)收集疑似結(jié)核病患者的痰液進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)液體分枝桿菌培養(yǎng)管(mycobacterium growth indicator tube，MGIT)培養(yǎng)法相較于中和離心固體培養(yǎng)陽(yáng)性率提高了30.3%(29.7%比22.8%)[8]。另一項(xiàng)在埃塞俄比亞進(jìn)行的研究也發(fā)現(xiàn)，液體MGIT培養(yǎng)法的陽(yáng)性率提高了30%(26%比20%)[9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者也開(kāi)展了類(lèi)似的研究，吳學(xué)兵等[10]在上海市松江區(qū)開(kāi)展的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)疑似新發(fā)肺結(jié)核患者，液體MGIT培養(yǎng)法的陽(yáng)性率為32.0%，中和離心固體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率為17.9%；王曉艷等[11]對(duì)確診肺結(jié)核患者的研究發(fā)現(xiàn)，液體MGIT培養(yǎng)法的陽(yáng)性率比簡(jiǎn)單固體培養(yǎng)高23.5%(57.2%比46.3%)。本研究結(jié)果與上述國(guó)內(nèi)外研究一致，發(fā)現(xiàn)手工液體培養(yǎng)法的陽(yáng)性率比中和離心固體培養(yǎng)法高28.8%。培養(yǎng)陽(yáng)性率提高可以得到更多的臨床菌株，可以對(duì)更多的結(jié)核病患者進(jìn)行耐藥檢測(cè)，同時(shí)，也能發(fā)現(xiàn)更多的NTM患者，從而為臨床診斷和治療提供更準(zhǔn)確的指導(dǎo)。

手工液體培養(yǎng)法可以顯著縮短報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)疑似患者的手工MGIT培養(yǎng)法的平均報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間為13.63 d，而中和離心固體培養(yǎng)法為28.67 d[10]。王曉艷等[11]報(bào)道的自動(dòng)化液體MGIT培養(yǎng)法涂陽(yáng)標(biāo)本的平均報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間僅為8.75 d，涂陰標(biāo)本為16.04 d。國(guó)外研究的結(jié)果與國(guó)內(nèi)相似，發(fā)現(xiàn)MGIT培養(yǎng)法的平均報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間在2至 3周內(nèi)[8-9]。本研究的手工液體培養(yǎng)法中位報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間為2周，近95%的陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間在4周內(nèi)，均顯著短于中和離心固體培養(yǎng)法。此外，由于本研究中每周僅對(duì)手工液體培養(yǎng)管觀察2次，對(duì)中和離心固體培養(yǎng)管觀察1次，因此，實(shí)際報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間很可能短于本研究報(bào)告的報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間。

本研究中，手工液體培養(yǎng)法的污染率為10.4%，高于國(guó)內(nèi)研究報(bào)道的手工MGIT培養(yǎng)法的5.8%和儀器MGIT培養(yǎng)法的6.2%[12]，也高于國(guó)外研究報(bào)道的手工MGIT培養(yǎng)法的1.4%[13]。但是，早些年以及近些年也有研究報(bào)道MGIT培養(yǎng)法的污染率在15%左右[9,14]。本研究中和離心固體培養(yǎng)法的污染率為10.5%，明顯高于國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道的4.0%[10]，也高于國(guó)外的9.3%[9]?？傊狙芯渴止ひ后w培養(yǎng)法的污染率略高于正常值，但中和離心固體培養(yǎng)法的污染率是正常值的兩倍。目前對(duì)導(dǎo)致污染率高的具體原因還不清楚。盡管在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們盡量嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程，但由于我們使用的是商品化的培養(yǎng)基和消化液等耗材，未對(duì)其不同批次產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。同時(shí)，我們盡管在保質(zhì)期內(nèi)使用這些耗材，但存儲(chǔ)時(shí)間長(zhǎng)是否會(huì)影響污染率也不清楚，這些都有待今后的工作中予以解決。

目前我國(guó)縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室大多未開(kāi)展痰培養(yǎng)，在開(kāi)展的地區(qū)也主要是采用固體培養(yǎng)方法，本研究證明手工液體培養(yǎng)法相比于中和離心固體培養(yǎng)法，不僅顯著提高了陽(yáng)性率，而且明顯縮短了報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間。手工液體培養(yǎng)法的操作并不復(fù)雜，試劑和儀器經(jīng)濟(jì)可及。手工液體培養(yǎng)法僅需要1支培養(yǎng)管(中和離心固體培養(yǎng)法需要2支，簡(jiǎn)單固體培養(yǎng)法需要4支)，其成本與固體培養(yǎng)法相當(dāng)。此外，手工MFLM培養(yǎng)法能多檢出30%菌陽(yáng)肺結(jié)核患者，更利于藥物敏感試驗(yàn)的開(kāi)展，可以發(fā)現(xiàn)更多耐藥患者，為診斷和治療提供指導(dǎo)，從而降低結(jié)核病的疫情。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)邱勇：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章；李蒙：分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱、統(tǒng)計(jì)分析；屈榕：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)；田發(fā)君：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)