楊攀平，丁炎，仲夢園，李銳，呂璨，徐江南， 孫恬晉，盧河東,2*

(1.淮陰工學院 生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223001；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，又名脲烷(urethane)，是一種廣泛存在于各種發(fā)酵食品、飲料、煙草和被污染的環(huán)境空氣中的致癌物[1-2]，因其對人體有潛在的致毒性和致癌性，2007年被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(IARC)列為2A類致癌物[3]。研究表明氨基甲酸乙酯普遍存在于調味品(醬油、食醋)和發(fā)酵飲品(白酒、黃酒)中，人體不可避免地暴露其中[4]，因此探索有效可行的降解氨基甲酸乙酯的方法對保障食品安全具有重要意義。

隨著人們生活水平和生活質量的提高，食品安全問題成為社會熱點[5]。目前有效減除食品中殘留的氨基甲酸乙酯常用方法有減少氨基甲酸乙酯生物合成的前體物質[6]；通過高通量篩選技術和基因工程技術分離或者改造具有脲酶活性和氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株以及優(yōu)化發(fā)酵工藝[7]等。基于成本和生物安全性等因素限制，不斷挖掘優(yōu)質食源性氨基甲酸乙酯降解菌株成為經(jīng)濟、有效的防控途徑。

本實驗從甜酒酒曲中篩選到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的菌株，通過形態(tài)學觀察、生理生化鑒定及16S rDNA基因序列分析進行種屬鑒定，采用單因素實驗及正交實驗分析得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件，以期為后續(xù)的生產應用提供研究基礎。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

湖北宜昌甜酒酒曲。

1.1.2 主要實驗試劑與儀器

大豆蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖(均為分析純試劑)：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銅、硫酸銨、氯化銨、氨基甲酸乙酯、溴甲酚紫、苯酚、次氯酸鈉、亞硝基鐵氰化鈉：阿拉丁公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒(E.Z.N.A.DNA Bacterial DNA Kit)：北京諾博萊德科技有限公司。

Eppendorf冷凍離心機、Eppendorf PCR儀、Eppendorf 移液槍 德國Eppendorf股份有限公司；722紫外分光光度計、電泳儀。

顯色劑 Ⅰ：準確稱取苯酚60 g、亞硝基鐵氰化鈉2.5 g定容于1 L水中后于冰箱中冷藏；顯色劑Ⅱ：準確稱取52.5 g NaOH、30 mL次氯酸鈉定容于1 L容量瓶后于冰箱中冷藏；終止劑：10%的三氯乙酸。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，2%(W/V)瓊脂。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加入2%(W/V)瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：酵母粉24 g/L，蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，KH2PO42.32 g/L，溴甲酚紫1.0 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：牛肉浸膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 產氨基甲酸乙酯水解酶菌株的篩選

1.2.1.1 高溫培養(yǎng)法

將甜酒酒曲粉碎混勻，準確稱取5 g置于50 mL無菌水中，在180 r/min的搖床中振蕩20 min，將菌懸液進行適當?shù)臐舛忍荻认♂?，?00 L稀釋液涂布于肉湯培養(yǎng)基上，在50 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 高鹽處理法

將甜酒酒曲粉碎后，準確稱取5 g置于50 mL無菌水中，于37 ℃，180 r/min搖床中振蕩20 min。菌懸液經(jīng)過適當?shù)南♂尯笕?00 μL涂布于高鹽培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

初篩：待平板長出菌落后，用記號筆標記并將菌落轉移至裝有篩選培養(yǎng)基的96深孔板中，于恒溫振蕩器(37 ℃，200 r/min)中培養(yǎng)24 h，選取培養(yǎng)基變?yōu)樽仙木w作為初篩得到的目的菌株。

復篩：將初篩獲得的菌株接種至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在37 ℃的搖床中培養(yǎng)24 h，轉速為180 r/min。將菌液置于離心管中，于冷凍離心機(4 ℃)中5500 r/min離心10 min，并用 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體，制備混懸液，在0 ℃下進行超聲破碎，待菌液變澄清為止，并檢測酶活。

1.2.2 產氨基甲酸乙酯水解酶的菌株鑒定

1.2.2.1 菌株的形態(tài)學與生理生化鑒定

將復篩所選菌株經(jīng)染色、光學顯微鏡觀察菌體個體及群體形態(tài)，生理生化反應參照《微生物學實驗指導》[8-9]。

1.2.2.2 16S rDNA 基因序列分析

參照Omega革蘭氏陽性菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行提取，提取篩選菌株的基因組，用細菌16S rDNA通用引物進行16S rDNA序列擴增并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將測序結果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對分析，利用MEGA 9.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 氨基甲酸乙酯酶活測定方法

1.2.3.1 氨基甲酸乙酯酶活定義

在常壓37 ℃，pH 7的條件下，每1 min分解1 nmol氨或1 nmol乙醇的酶量為1個酶活單位(U)[10]。

1.2.3.2 酶活測定方法——Berthelot reaction

用比色法測定氨基甲酸乙酯水解酶的酶活，取酶液1 mL，加入1 mL 3%氨基甲酸乙酯溶液，37 ℃反應30 min，加入1 mL終止液，37 ℃反應30 min，加入1 mL終止液，混勻后加入1 mL顯色劑Ⅰ和1 mL顯色劑Ⅱ，強烈振蕩，37 ℃保溫20 min后取出，用超純水稀釋到10 mL，在625 nm處比色，并記錄OD值[11]。

1.2.4 標準曲線繪制

用氯化銨配制不同濃度的標準溶液，在625 nm下測定吸光值，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 NH4Cl 標準曲線Fig.1 The standard curve of NH4Cl

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

按3%的接種量對氮源、碳源、金屬離子(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Mg2+)等培養(yǎng)基條件進行設計，24 h后取樣測定氨基甲酸乙酯水解酶活性。

1.2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化

選用溫度、pH、接種量和裝液量等發(fā)酵條件，24 h后取樣測定氨基甲酸乙酯水解酶活性，研究其對解淀粉芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶活性的影響。

1.2.7 正交實驗(設計正交表)

選取單因素實驗中對解淀粉芽孢桿菌酶活性影響顯著的3個因素(氮源濃度、碳源濃度、金屬離子)進行三因素三水平正交實驗(見表1)，以菌株分解EC的活性為考察指標，探究該菌株的最佳產酶條件。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2019b 作圖，采用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析和正交實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，實驗均為3組平行。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

經(jīng)過不同的初篩條件從甜酒酒曲中分離活的23株菌，通過篩選培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，篩選出能夠產生氨基甲酸乙酯水解酶的兩株菌LPB-13和LPB-19。將其接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后利用Berthelot reaction 比色法測定酶活性，LPB-13的酶活為360 U/L，LPB-19的酶活為820 U/L。結果表明，兩株菌的氨基甲酸乙酯水解酶活性差異顯著，其中LPB-19的酶活性更強，因此將其作為后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化對象。

2.2 氨基甲酸乙酯水解酶產生菌株形態(tài)學與生理生化鑒定

菌株 LPB-19呈短桿狀，染色均勻，革蘭氏染色陽性，可形成內生孢子，在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng),培養(yǎng)基表面形成菌膜。在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，菌落邊緣不規(guī)則，濕潤有黏性。接觸酶實驗陽性，氧化酶實驗陰性。該菌株需氧生長；甲基紅陰性；石蕊牛奶實驗中，細菌產蛋白酶使牛奶胨化；產凝乳酶使牛奶凝固，能水解淀粉，耐受10%的NaCl。糖發(fā)酵實驗中，不能利用鼠李糖、D-木糖、α-乳糖，結果見表2。通過上述形態(tài)及生理生化特征，初步將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。鑒于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為近源種，且生理特征接近，為了更進一步分離枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，本實驗進行了16S rDNA序列分析。

表2 菌株 LPB-19生理生化特性Table 2 The physiological and biochemical properties of strain LPB-19

續(xù) 表

2.3 氨基甲酸乙酯水解酶產生株16S rDNA基因序列分析

以菌株LPB-19基因組DNA為模板，利用16S rDNA通用引物擴增，PCR擴增產物經(jīng)純化后進行測序，對該序列進行Blast分析，結果顯示菌株LPB-19與B.amyloliquefaciensDSW 7相似性達到99.4%，利用 MEGA 4.1構建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。結合前期形態(tài)學及生理生化分析結果，菌株LPB-19被鑒定為B.amyloliquefaciens。

圖2 B. amyloliquefaciens LPB-19 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 The phylogenetic tree analysis of B. amyloliquefaciens LPB-19 16S rDNA gene

2.4 培養(yǎng)基成分對菌株生長的影響

2.4.1 碳源及其濃度對菌株產酶的影響

碳源對菌珠LPB-19酶活性的影響見圖3。解淀粉芽孢桿菌LPB-19均能利用果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖，以麥芽糖為碳源時菌體生長最為旺盛，其氨基甲酸乙酯水解酶活性最高；其次為蔗糖，其中以果糖為碳源的菌株的生物量最小，菌株的酶活最低；相比之下，菌株在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中主要以營養(yǎng)生長為主，其菌體干重僅次于麥芽糖，但菌株的產酶活性較低(見圖3中a)。由于麥芽糖生產成本高，市場價格較為昂貴，考慮到工業(yè)化生產成本，選擇蔗糖為碳源?？疾觳煌瑵舛鹊恼崽菍Ξa酶量的影響，最佳濃度為20 g/L，產酶活力為2367.5 U/L(見圖3中b)。

2.4.2 氮源及其濃度對菌株產酶的影響

氮源對菌珠酶活性的影響見圖4。以蛋白胨為氮源時菌株的產酶活性最高，而菌株在無機氮源培養(yǎng)基中的生長量低，與有機氮的差異顯著，故以蛋白胨為氮源。同時，可以看出蛋白胨的最佳濃度為10 g/L，產酶活性提高至2117 U/L。

2.4.3 金屬離子對菌株產酶的影響

選用4種常見金屬離子Cu2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+，探究了不同質量濃度的金屬離子對解淀粉芽孢桿菌產氨基甲酸乙酯水解酶的影響，結果見表3。

表3 4種金屬離子不同濃度對酶活的影響Table 3 Effects of different concentration of four metal ions on urethanase activity

由表3可知，不同質量濃度和種類的金屬離子對菌株的產酶有不同的影響，其中添加Cu2+、Mn2+、Fe3+時不利于產酶，而添加Mg2+至0.05 g/L時，菌株的酶活性為1604.4 U/L，相比于優(yōu)化前提高了2倍，選擇Mg2+的最適濃度為0.05 g/L。

2.5 菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖5可知，解淀粉芽孢桿菌LPB-19在31～37 ℃生長狀況差異不顯著，但在33 ℃時酶活最高(見圖5中a)。在33 ℃條件下，LPB-19在pH值5～8范圍內均能生長，而在pH 6時酶活最高(見圖5中b)；在33 ℃，pH 6的條件下，150 r/min下的菌體干重顯著低于180，210，240 r/min，而180 r/min下LPB-19的酶活性顯著高于其他轉速(見圖5中c)；在上述優(yōu)化條件下，接種量為3%時菌株具有較高的酶活(見圖5中d)。綜上所述，解淀粉芽孢桿菌LPB-19在33 ℃、pH 6、轉速180 r/min、接種量3%時具有較高的酶活性。

2.6 正交實驗

在最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎上，對單因素優(yōu)化實驗結果再設計L9(33)正交實驗，對蔗糖濃度、蛋白胨濃度和硫酸鎂濃度3個因素之間的相互作用進行進一步的探索，結果見表4。根據(jù)實驗的Kn和R值，得出最佳發(fā)酵方案是A3B2C2，即蔗糖25 g/L，蛋白胨12.5 g/L，硫酸鎂0.075 g/L，此時的酶活性為4477.02 U/L，是優(yōu)化前的5.45倍。

表 4 產酶條件優(yōu)化正交實驗結果與分析Table 4 Orthogonal test results and analysis of enzyme production conditions optimization

3 討論

氨基甲酸乙酯是一種廣泛存在于各種調味品、發(fā)酵飲品、煙草以及被污染的環(huán)境空氣中的2A類致癌物[12]，是一種對位點致癌物，能誘發(fā)肺癌和淋巴癌等疾病，其毒理作用也隨著作用時間和劑量的增加而增強[13]。氰化物和尿素是氨基甲酸乙酯的重要前體物質，在食品發(fā)酵過程中可與乙醇作用產生EC，因此減少其在發(fā)酵過程中的積累對降低EC至關重要[14]。本實驗從甜酒酒曲中分離篩選獲得一株內源性氨基甲酸乙酯水解活性的菌株，經(jīng)生物學鑒定確定為B.amyloliquefaciensLPB-19。

解淀粉芽孢桿菌廣泛存在于食物、土壤、植物、動物以及一些極端的環(huán)境中，美國食品和藥物管理局(FDA)已將其列為安全無毒的微生物，且基于其優(yōu)越的生物學功能，已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農業(yè)以及環(huán)境等各個領域中[15-16]，本實驗從甜酒酒曲中篩選的菌株LPB-19能適應多種環(huán)境，氨基甲酸乙酯降解性能穩(wěn)定且屬于食品安全菌株，相比于酵母菌Y13[17]，其去除氨基甲酸乙酯更具有優(yōu)勢。丁霞等[18]從白酒酒醅中篩選出一株同時能降解氨基甲酸乙酯及其前體尿素的解淀粉芽孢桿菌。孟慶達[19]從白酒酒曲中篩選出高脲酶活性的腐生葡萄球菌，其尿素和氨基甲酸乙酯去除率分別為78.8%、50.3%。李京京等[20]從小鼠腸道篩選出具有降解氨基甲酸乙酯活性的賴氨酸芽孢桿菌SC02，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，最終氨基甲酸乙酯降解酶活高達7066 U/L，與原始培養(yǎng)基的酶活相比提高了350%，說明菌株的氨基甲酸乙酯水解活性受到培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件以及復雜的代謝調控影響[21]，在本實驗中也得到了相同的實驗結果，通過發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組分優(yōu)化，最終氨基甲酸乙酯降解酶酶活達到4477 U/L，相比于原始培養(yǎng)基提高了432%。該菌產生最大的氨基甲酸乙酯水解活性在6.0左右，說明降解氨基甲酸乙酯的物質具有較好的耐酸性，這與已報道的氨基甲酸乙酯降解菌株膠紅酵母、賴氨酸芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌的最適pH 7.0不同[22]，而發(fā)酵體系常以酸性環(huán)境為主，由此看來，本實驗獲得的解淀粉芽孢桿菌LPB-19在去除氨基甲酸乙酯方面更具有優(yōu)勢，因此其在食品發(fā)酵中更具有應用價值。

本研究對B.amyloliquefaciensLPB-19菌株的培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并進行該菌株的氨基甲酸乙酯降解活性評估，結果表明LPB-19具有較高的氨基甲酸乙酯降解活性，具有降解釀造類調味品、發(fā)酵飲品中氨基甲酸乙酯的潛力。在后續(xù)的研究中，我們將進行氨基甲酸乙酯降解酶的分離、鑒定和純化以及通過基因工程方法進行菌株改造，構建生物相容性高、降解活性強的工程菌株，以期可將具有EC降解活性的解淀粉芽孢桿菌作為發(fā)酵劑直接加入調味品或者發(fā)酵飲品的釀造體系中，降解氨基甲酸乙酯，保障食品安全。