李俊彥 招軒娜

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524001）

非小細(xì)胞肺癌是一種惡性腫瘤，發(fā)病率約占肺癌的80%。肺癌患者通常預(yù)后不良，在早期時易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但目前關(guān)于肺癌的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。本研究旨在探討非小細(xì)胞肺癌中CDKN2A蛋白表達(dá)及其與臨床分期及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2019年10 月至2020年10月我院收治并手術(shù)治療的非小細(xì)胞肺癌患者80例作為研究對象，其中男性48例，女性32例；年齡33～75（60.82±11.23）歲；腺癌 45例，鱗癌 35例。

1.2 方法：采用Western-blot 法測定非小細(xì)胞肺癌組織及非腫瘤組織中CDKN2A 的表達(dá)，提取標(biāo)本中的總RNA，采用RT-PCR 試劑盒擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為 25μL，包括 4μL RNA 模板，上游引物 2μL，下游引物 2μL，2×Tap PCR Master Mix12μL，剩余為雙蒸水。95 ℃預(yù)處理5 min 后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)，熱變性溫度為95℃，時間為30s；延伸溫度為72℃，時間為30s；退火時間為 30s；退火溫度為 60℃、61℃、59℃，均為30個循環(huán)；最后進(jìn)行延伸，時間為10 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。采用常規(guī)蛋白提取法提取腫瘤組織和非腫瘤喉組織中的總蛋白，行電泳分離，利用硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用濃度為5%的脫脂奶粉并加1 倍磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉，置于4℃下保存。取出后與CDKN2A 進(jìn)行反應(yīng)，以 1∶1000 的比例進(jìn)行稀釋，室溫下放置1 h，第二抗體用辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔抗體，以1∶1000 的比例進(jìn)行稀釋，溫下放置1h，采用 DAB 顯色試劑 1∶100 比例稀釋后顯色，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶密度值。評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分：陽性細(xì)胞比例低于5%；1 分：陽性細(xì)胞比例為5%～25%；2 分：陽性細(xì)胞比例為26%～50%；3分：陽性細(xì)胞比例為51%～75%；4 分：陽性細(xì)胞比例超過75%。染色強(qiáng)度：0 分：無著色，1 分：黃色，2分：棕黃色，3 分：棕褐色；最終評分為兩項(xiàng)得分的乘積：陰性組：得分低于3 分，陽性組：得分≥3 分，其中低表達(dá)：得分低于5 分，高表達(dá)：得分≥5 分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：運(yùn)用SPSS20.0 軟件行數(shù)據(jù)分析，計量資料以[n（%）]形式顯示，采用 χ2檢驗(yàn)；計數(shù)以（）形式顯示，采用 t 檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDKN2A 蛋白水平的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系：CDKN2A 表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞胞漿中，呈為棕黃色染色顆粒。CDKN2A 蛋白在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的高表達(dá)率為58.75%，在癌旁組織中的高表達(dá)率為23.75%，非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的CDKN2A 蛋白表達(dá)高于癌旁組織（χ2=20.220，P=0.000）。非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的CDKN2A 蛋白水平的表達(dá)與臨床分期的有關(guān)（P<0.05），詳見表1。

表1 CDKN2A 蛋白與臨床分期的關(guān)系

2.2 CDKN2A 蛋白與預(yù)后的關(guān)系：CDKN2A 蛋白高表達(dá)非小細(xì)胞肺癌患者總生存期低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=1.31，P=0.01）；CDKN2A 高低表達(dá)組間非小細(xì)胞肺癌患者無疾病進(jìn)展生存差異無統(tǒng)計學(xué)意義（HR=0.93，P=0.58）。

3 討論

肺癌是一種高發(fā)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌的惡性程度較高，切治療難度較大，故及早發(fā)現(xiàn)對預(yù)防非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移具有十分重要的意義。因此，參與細(xì)胞周期調(diào)控、基因改變等成為臨床研究熱點(diǎn)。CDKN2A 直接參與了細(xì)胞周期調(diào)控，是一種新型的抗癌基因，被稱為細(xì)胞周期中的剎車裝置，若發(fā)現(xiàn)其失靈后則會使細(xì)胞發(fā)生惡性增殖，進(jìn)而形成惡性腫瘤[3]。研究發(fā)現(xiàn)，CNKN2A 在多種腫瘤組織中均呈現(xiàn)出差異表達(dá)，且呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，與患者的病理特征與預(yù)后具有相關(guān)性[4]。然而，CDKN2A在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的研究報道較少，CD KN2A高低表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后情況也尚不明確[5]。CDKN2A 基因在細(xì)胞周期調(diào)控中具有較明顯的腫瘤抑制作用，CDKN2A 在許多腫瘤中均出現(xiàn)丟失和突變。探討CDKN2A 在非小細(xì)胞肺癌組織中的差異表達(dá)，可能發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞生物學(xué)功能及患者預(yù)后的關(guān)系。

賀小威等的研究結(jié)果曾報道[6]，非小細(xì)胞肺癌組織中CDKN2A 蛋白的表達(dá)顯著高于癌旁組織，CDKN2A 蛋白表達(dá)水平與患者的OS 有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，本研究結(jié)果與賀小威等[6]的數(shù)據(jù)基本一致。結(jié)果說明CDKN2A 蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，CDKN2A 蛋白的高表達(dá)與患者的臨床分期和預(yù)后較差有關(guān)。

綜上所述，CDKN2A 蛋白在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與患者的臨床分期和生存期有關(guān)，CDKN2A 可作為非小細(xì)胞肺癌患者臨床分期及預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物。但本研究僅從生物信息的層面進(jìn)行了證實(shí)，后期仍需進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。