于 夢，孫 玲，張 云，孟祥璟

（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

人體皮膚中起保濕作用的物質(zhì)稱為天然保濕因子（NMF）[1-2]，NMF主要由游離氨基酸及其代謝產(chǎn)物（如吡咯烷酮羧酸和尿刊酸）組成[3]。吡咯烷酮羧酸（PCA）是谷氨酰胺的代謝產(chǎn)物[4]，作為一種具有優(yōu)良吸濕性能的保濕劑大量存在于皮膚角質(zhì)層中[5]。尿刊酸（UCA）是組氨酸的咪唑丙烯酸衍生物[6]，以反式（trans-UCA）存在于皮膚角質(zhì)層中，在紫外線作用下會由反式轉(zhuǎn)變成順式（cis-UCA），從而對皮膚起一定的防護(hù)作用[7-8]。在干燥和鱗片狀的皮膚中，經(jīng)常觀察到較低水平的吡咯烷酮羧酸和尿刊酸[9]。

國內(nèi)外關(guān)于吡咯烷酮羧酸、尿刊酸測定的文獻(xiàn)報道中，前處理過程有的使用大比例水相提取后氮吹濃縮，有的使用加入丙二醇的PBS溶液提取，有的使用堿性溶劑提取后中和，然后采用C18色譜柱進(jìn)行分離，使用紫外檢測器和質(zhì)譜檢測器進(jìn)行檢測[10-17]。已有的方法提取過程繁瑣復(fù)雜，在C18柱分離時存在吡咯烷酮羧酸與溶劑峰分不開的問題。有人為避免溶劑干擾而使用多波長切換檢測，或使用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行檢測。本文建立的皮膚貼片的處理檢測方法，超聲提取后直接進(jìn)樣，使用紫外檢測器進(jìn)行檢測，極大簡化了樣品的前處理過程，解決了同一色譜條件下主成分與溶劑峰、雜質(zhì)峰分不開等問題。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Angilent1260高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器（美國安捷倫）； AE240萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；XS205DU十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Seven Excellence多參數(shù)測定儀（梅特勒-托利多公司）；TGL-16gR離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

吡咯烷酮羧酸鈉（批號：Y05D9S76767，純度≥98 %），反式尿刊酸（批號：205D9H76812，純度：98 %），順式尿刊酸（批號：105D9J76856，純度≥98 %，上海源葉）；甲醇（色譜純，天津康科德）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團(tuán)）；庚烷磺酸鈉（色譜純，山東禹王）；磷酸（色譜純，天津市科密歐）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo BetaBasic Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）（3:97）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取皮膚貼片樣品1片，置于2 ml具塞離心管中，膠黏劑一面朝內(nèi)，加0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）1.0 ml，超聲30 min，離心，取上清，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液 精密稱取吡咯烷酮羧酸鈉50.47 mg，反式尿刊酸10.21 mg和順式尿刊酸10.33 mg，分別置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為各對照品儲備液。分別精密量取各對照品儲備液1 ml，置同一100 ml量瓶中，用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）稀釋至刻度，配成每1 ml分別含吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸各50.47 μg，10.21 μg，10.33 μg的混合對照品儲備液。將混合對照品儲備液稀釋10倍，即得對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 取空白膠帶1片，加0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）1.0 ml，超聲30 min，離心取上清，作為陰性樣品溶液。

2.3 專屬性

取陰性樣品溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μl，按2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，陰性樣品溶液在吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸出峰位置無干擾。

圖1 專屬性試驗HPLC圖譜

2.4 檢測限和定量限

取對照品溶液逐步稀釋，至各成分的信噪比S/N接近10作為定量限，至各成分的信噪比S/N接近3作為檢測限。結(jié)果，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的定量限分別為0.1009，0.02042，0.02066 μg/ml，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的檢測限分別為0.05045，0.01021，0.01033 μg/ml。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗

取同一份對照品溶液，分別在0，1，4，8，12，24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，觀察待測成分峰面積的變化情況。結(jié)果吡咯烷酮羧酸鈉峰面積的RSD為0.36 %，反式尿刊酸峰面積的RSD為0.48 %，順式尿刊酸峰面積的RSD為0.64 %，表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 線性關(guān)系考察

取混合對照品儲備液，逐級稀釋，制成線性供試品溶液。按2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得回歸方程。線性試驗結(jié)果表明，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

2.7 精密度試驗

2.7.1 重復(fù)性 取空白膠帶6張，分別加入混合對照品儲備液0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，外標(biāo)法計算各待測成分含量，并計算RSD。結(jié)果顯示，吡咯烷酮羧酸鈉含量的RSD為1.01 %，反式尿刊酸含量的RSD為0.69 %，順式尿刊酸含量的RSD為0.93 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.2 中間精密度 為考察隨機(jī)變動因素對精密度的影響，在不同日期由不同人員另取空白膠帶6張，分別加入混合對照品儲備液0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備6份供試品溶液，在不同高效液相色譜儀上按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，外標(biāo)法計算各待測成分含量。本試驗結(jié)果與重復(fù)性結(jié)果共計12份樣品中吡咯烷酮羧酸鈉含量的RSD為0.98 %，反式尿刊酸含量的RSD為0.86 %，順式尿刊酸含量的RSD為1.14 %。由結(jié)果可知，方法中間精密度良好。

2.8 加樣回收試驗

取空白膠帶3張，分別加入混合對照品儲備液（吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸濃度分別為50.48，10.24，10.22 μg/ml）0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備3份供試品溶液，作為100 %水平供試品，同法制備50 %和150 %水平供試品各3份，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計算待測成分的回收率。測得吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的回收率分別為92.67 %，98.49 %，98.95 %，RSD分別為2.61 %，1.16 %，0.67 %，表明該方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）

2.9 耐用性試驗

取空白膠帶1張，加入混合對照品儲備液0.1 ml并晾干，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，作為耐用性樣品溶液。分別改變色譜條件中鹽的pH值、離子對試劑濃度、有機(jī)相比例、柱溫、檢測波長及流速，取耐用性樣品溶液和對照品溶液進(jìn)樣，記錄峰面積，外標(biāo)法計算含量。結(jié)果各峰之間分離度均大于1.5，含量的RSD小于2 %，表明本方法的耐用性良好。具體結(jié)果見表3。

表3 耐用性試驗結(jié)果

2.10 樣品測定

取10批樣品，按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算供試品溶液中3種待測成分的含量。樣品測定結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

目前分離吡咯烷酮羧酸鈉和尿刊酸的色譜柱主要為C18柱[10-17]，實驗考察了Agilent ZOBAX SBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shim-Pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱對目標(biāo)物的分離情況。通過減少有機(jī)相比例、調(diào)整pH值及加入離子對試劑等方式進(jìn)行試驗，結(jié)果均顯示吡咯烷酮羧酸鈉與溶劑峰無法分離。經(jīng)分析，吡咯烷酮羧酸鈉的結(jié)構(gòu)中存在較大共軛體系，在苯基柱上可能有較好選擇性，因此改用苯基柱進(jìn)行試驗。通過試驗發(fā)現(xiàn)，吡咯烷酮羧酸鈉在Thermo苯基柱上保留較好，與溶劑峰可實現(xiàn)較好分離，因此本文選擇Thermo BetaBasic Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行實驗。

3.2 流動相的選擇

為增加吡咯烷酮羧酸鈉的保留，選擇甲醇-磷酸二氫鉀緩沖鹽體系進(jìn)行試驗，但效果并不理想。后加入離子對試劑庚烷磺酸鈉，通過調(diào)整流動相比例及離子對試劑的濃度，吡咯烷酮羧酸鈉可與溶劑峰實現(xiàn)完全分離，但峰形較差，且樣品中吡咯烷酮羧酸鈉峰會與部分雜峰重疊。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，降低pH值可顯著改善峰形并適當(dāng)延長保留時間，從而使吡咯烷酮羧酸鈉能與溶劑峰和樣品中的雜峰實現(xiàn)較好分離。因此，實驗最終選擇甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）（3:97）為流動相，此條件下目標(biāo)分析物分離度好，基線平穩(wěn)。

3.3 提取溶劑的選擇

為了簡化提取過程，盡量減少中和、濃縮等提取過程，考察了不同提取溶劑對皮膚貼片中的吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸提取后離心直接進(jìn)樣的效果。以加入一定量的吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸的空白皮膚貼片作為樣品，分別用甲醇、不同體積比的甲醇-水溶液和0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）對其進(jìn)行相同時間的超聲提取。結(jié)果表明，使用甲醇進(jìn)行提取時吡咯烷酮羧酸鈉提取回收率較低，使用不同體積比的甲醇-水溶液進(jìn)行提取時反式尿刊酸和順式尿刊酸峰形較差，分別分裂為兩個峰。使用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（含庚烷磺酸鈉5 mmol/L，磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）作為提取溶劑時，吡咯烷酮羧酸鈉、反式尿刊酸和順式尿刊酸都能很好的分散在提取溶劑中，且目標(biāo)峰的峰形較好，提取回收率在90 %以上。

本文建立了皮膚角質(zhì)層貼片中吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸和順式尿刊酸含量測定的HPLC方法。結(jié)果表明，該方法樣品處理過程簡便，可操作性強(qiáng)，可實現(xiàn)同一色譜條件下吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸、順式尿刊酸與溶劑峰及其他皮膚成分色譜峰的較好分離，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于皮膚角質(zhì)層貼片中吡咯烷酮羧酸、反式尿刊酸和順式尿刊酸的準(zhǔn)確測定。